免疫組化考試必備-資料下載頁
2025-06-07 16:27本頁面
【正文】 法，可靠易行 雜交適宜溫度范圍較寬，較穩(wěn)定，不易降解cDNA探針的缺點：要用凝膠電泳移除載體序列 探針需變性 雜交反應(yīng)中可能存在自身復(fù)性RNA探針的優(yōu)點：模板反復(fù)多次轉(zhuǎn)錄，一次合成和標(biāo)記量高 單鏈分子，在組織內(nèi)通透性好，雜交效率比DNA探針高 RNAmRNA雜交體比DNAmRNA雜交體穩(wěn)定 通過改變外源性DNA的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可轉(zhuǎn)錄出正義RNA鏈和反義RNA鏈 雜交體所需解鏈溫度高，能耐受雜交過程中的較高溫度及雜交后的洗滌 標(biāo)記后用不含RNA酶的DNA酶去除模板DNA，不需再純化 雜交后用RNA酶去除非特異性吸附的RNA探針RNA探針的缺點：容易受RNA酶污染 制備過程復(fù)雜 雜交適宜的溫度范圍較窄寡核苷酸探針的優(yōu)點：探針一般較?。?0~50bp），在組織內(nèi)通透性好 為單鏈DNA寡核苷酸，雜交時無需變性，無自身雜交 一次合成，可使用多時，價格低廉 對RNA酶不敏感，比RNA探針更穩(wěn)定，便于操作寡核苷酸探針的缺點：與mRNA形成的雜交體不如RNARNA穩(wěn)定 探針較短，所攜帶的標(biāo)記物較少，特異性、敏感性都低 標(biāo)記方法受限制，只能采用末端標(biāo)記法探針的標(biāo)記方法及原理：雙鏈cDNA探針的標(biāo)記：隨機(jī)引物法 RNA探針標(biāo)記：在體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)中與探針制備同時完成 寡核苷酸探針標(biāo)記：主要是末端標(biāo)記法*理想的標(biāo)記物應(yīng)具備的條件：標(biāo)記后探針的分子結(jié)構(gòu)盡可能與原來的分子結(jié)構(gòu)相同 標(biāo)記后探針的檢測方法要簡便、準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好 安全無害*目前常用標(biāo)記物有同位素（35S、32P、33P 和3H）和非同位素（生物素、地高辛）兩大類。組織樣品制備時的注意事項：去除或抑制RNA酶：包括物理和化學(xué)方法 取材及固定：要求組織新鮮，取材過程中防止RNA酶的污染；為避免組織細(xì)胞中核酸的降解，保存組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，可采用4%多聚甲醛等灌流或浸泡固定 包埋和切片：操作過程中要防止RNA酶污染，要求戴手套操作、切片刀用DEPC水擦拭，鑷子消毒后使用 玻片的處理：玻片上涂上粘附劑，防脫處理后高溫消毒原位雜交中可能會出現(xiàn)哪些問題，應(yīng)怎樣避免這些問題：@原位雜交實驗失?。禾结槪褐饕紤]探針的敏感性、探針的濃度、探針長度及保存的好壞等 組織材料的保存 實驗過程中防止RNA酶的污染，做到嚴(yán)格的無RNA酶操作 雜交前處理：包括蛋白酶消化的濃度、時間等 雜交的條件：時間、溫度等 雜交體的檢測 @脫片：玻片進(jìn)行防脫處理 注意雜交前預(yù)處理時蛋白酶的濃度和消化時間 防止雜交后漂洗過度 @非特異性染色：探針的特異性不高 組織細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性酶染色：%~5%H2O2和1mmol/L左旋咪唑分別處理以避免組織內(nèi)源性過氧化物酶和堿性磷酸酶的干擾 注意雜交后的漂洗：要用濃度遞減的SSC溶液在一定溫度和振蕩下漂洗切片：2X SSC→1X SSC→ SSC 37℃。原位雜交的特性以及與免疫組化的比較：@、特性：時間短：與免疫組化操作時間相近 技術(shù)簡單：雜交前預(yù)處理（蛋白酶消化等）→雜交反應(yīng)（滴加雜交液、變性、孵育雜交）→雜交后處理（洗滌封閉、免疫組化信號放大等） 保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)：為細(xì)胞原位標(biāo)記，不破壞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu) 可用于回顧性研究 可用于福爾馬林固定的組織 避免同位素的使用：可使用生物素或地高辛標(biāo)記 @、比較：敏感性：原位雜交較免疫組化有極高的敏感性 特異性：免疫組化常有血清學(xué)的交叉反應(yīng)，會出現(xiàn)背景和假陽性；而原位雜交特異性極高，根據(jù)堿基配對的原則，探針僅于靶基因序列雜交 福爾馬林的固定：對原位雜交的影響較免疫組化小 親和力：探針靶核酸的親和力強(qiáng)于抗原抗體的親和力，敏感性更高 應(yīng)用：當(dāng)不具備表達(dá)良好的、可用的抗體時，或抗體染色背景較深時可采用原位雜交的方法；當(dāng)待檢物為DNA或RNA時，只能選擇原位雜交的方法 *原位雜交時的陰性對照：雜交前用核酸酶處理：如果雜交信號明顯降低或消失，說明探針是與組織細(xì)胞中的核酸雜交 雜交液中省去探針：如果出現(xiàn)陽性反應(yīng)，說明這些信號是與雜交反應(yīng)無關(guān)的 用正義核酸探針：如果無雜交信號，表明探針的特異性 加過量未標(biāo)記探針雜交后再加標(biāo)記探針雜交：阻斷標(biāo)記探針與待測核酸的結(jié)合，如雜交信號消失或下降，表明探針雜交的特異性 Northern或Southern分析：如果在待測核酸的分子量大小處顯示一條雜交信號帶，表明探針的特異性 將標(biāo)記探針與未標(biāo)記探針按一定比例混合，然后雜交：如果雜交信號隨標(biāo)記探針量的增加而增加，說明探針是特異的*聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction,PCR）：又稱體外基因擴(kuò)增方法，這種技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制過程相似。影響PCR的因素：模板核酸 引物 緩沖液 Mg2+ 三磷酸脫氧核苷酸(dNTP) 耐熱DNA聚合酶 溫度循環(huán)參數(shù)：包括變性溫度與時間、復(fù)性溫度與時間、延伸溫度與時間以及循環(huán)數(shù) 其它因素PCR過程中如何防止污染的發(fā)生：PCR反應(yīng)前操作的地方和器材與反應(yīng)后的應(yīng)分開 所用的試劑應(yīng)分成若干份保存，避免長期重復(fù)使用造成試劑污染 加樣時DNA樣品應(yīng)最后加，并立即將管口蓋妥，避免空氣污染。原位PCR：又稱原位基因擴(kuò)增（In situ gene amplification），是在組織結(jié)構(gòu)（或細(xì)胞）保持不變的情況下，擴(kuò)增已知的引物片段，檢測組織（或細(xì)胞）內(nèi)相對應(yīng)的未知的（或低拷貝）基因序列，經(jīng)顯色反應(yīng)后，或經(jīng)原位雜交及顯色反應(yīng)后，在光鏡下觀察其擴(kuò)增的陽性信號，作定性或定位檢測的，以分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)為特征的一門技術(shù)。原位PCR過程中用到的技術(shù)有：組織學(xué)技術(shù) PCR擴(kuò)增技術(shù) 原位雜交技術(shù) 免疫組化技術(shù) 分子生物學(xué)技術(shù)原位PCR的四個基本步驟：樣本固定：目的是使整個循環(huán)過程中保持形態(tài)的完整 滲透：目的是為了讓擴(kuò)增試劑更多的進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)接近靶核酸 原位基因擴(kuò)增：可通過特異的引物和熱穩(wěn)定DNA聚合酶增加靶核酸的拷貝數(shù)達(dá)檢出水平 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測（可視化）*直接法原位PCR（Direct in situ PCR）：應(yīng)用的引物和三磷酸核苷酸分別標(biāo)以放射性同位素(如35S等)，非放射性同位素（如生物素和地高辛）進(jìn)行PCR原位擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)放射自顯影，免疫組化和親和組織化學(xué)方法進(jìn)行檢測，不需原位雜交檢測特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的一種檢測技術(shù)。*間接法原位PCR（Indirect in situ PCR）：應(yīng)用的引物和三磷酸核苷酸不帶任何標(biāo)記物，當(dāng)原位擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)原位雜交技術(shù)檢測，原位雜交所用的探針可特異性地檢出擴(kuò)增產(chǎn)物中的靶序列，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物中非靶序列成分的檢出，具有較高的特異性，又稱PCR原位雜交。*原位反轉(zhuǎn)錄PCR：是以mRNA為起始物，通過反轉(zhuǎn)錄合成靶序列的cDNA，然后以cDNA為模板施行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，以檢測細(xì)胞和組織內(nèi)mRNA靶序
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