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免疫組化基本技術(shù)(ppt102)-工藝技術(shù)-資料下載頁(yè)

2025-08-05 21:50本頁(yè)面

【導(dǎo)讀】?jī)?yōu)質(zhì)、高效,特異的一抗,敏感的檢測(cè)方法,界處,遠(yuǎn)離病灶的正常組織。組織大?。洪L(zhǎng)1cm×寬1cm×厚~。主要病灶,因此對(duì)標(biāo)本的處理應(yīng)特別慎重,及時(shí)固定,包埋時(shí)要平整。展IHC檢測(cè)的關(guān)鍵。定后,再進(jìn)行后固定。30min內(nèi)浸入固定液,尤其是開(kāi)展分子生物學(xué)工作。材要求心臟還在跳動(dòng)時(shí)取材。刀和剪要快,刀要足夠長(zhǎng)。壓于載玻片上,吹干后立即固定20~30min。液、腦脊液等體液多而細(xì)胞較少的標(biāo)本。培養(yǎng)的活細(xì)胞可分貼壁和懸浮二種。將細(xì)胞直接培養(yǎng)在蓋玻片上。和腐敗,以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿。該固定劑較適合于富含糖類組織,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。質(zhì)的沉淀而發(fā)生固定作用。定液的穿透力及濃度與固定時(shí)間成反比。組織固定后必須徹底沖洗。溶解在二甲苯類試劑中。脫水兼石蠟溶劑的脫水劑。Ⅲ乙醇,無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。95%乙醇Ⅲ過(guò)夜,無(wú)水乙醇Ⅰ30~60min,Ⅰ30min,石蠟Ⅱ1~2h,石蠟Ⅲ2~3h。

  

【正文】 目前商品化抗體已有上千種,一種抗體可以有數(shù)家公司生產(chǎn),其質(zhì)量的好壞也存在很大差異,首先應(yīng)選擇一家好的生產(chǎn)公司,根據(jù)文獻(xiàn)提供的信息,選擇所需試劑的型號(hào)。 (1)種屬:?jiǎn)慰寺】贵w,多克隆抗體 (2)能否用于石蠟切片 (3)稀釋度 (4)特異性,交叉反應(yīng) (5)用何種組織前處理形式 (6)包裝單位,價(jià)格 (1)癌基因與抗癌基因標(biāo)記物; (2)細(xì)胞凋亡標(biāo)記物; (3)各種信號(hào)傳導(dǎo)標(biāo)記物 (4)各種正負(fù)調(diào)控基因標(biāo)記物 (5)細(xì)胞增殖及調(diào)控標(biāo)記物; (6)凝集素類標(biāo)記物 (7)激素受體標(biāo)記物 (8)病毒性標(biāo)記物 (9)各類腫瘤標(biāo)記物 (10)耐藥基因標(biāo)記物 七、抗體最佳稀釋度的測(cè)定和保存 一抗稀釋度 特異性染色 非特異性染色 1:50 ++++ ++ 1:100 ++++ ++ 1:200 ++++ ++ 1:400 ++++ + 1:500 +++ (- ) 陰性對(duì)照 (- ) (- ) 抗體稀釋液是從事 IHC工作實(shí)驗(yàn)室必備,其制備方法如下: 1克明膠 (紅、綠 )溶在 300ml TBS中,加溫,攪拌使其溶解,待其冷卻后,加入 1克牛血清白蛋白和 100mg NaN3, 4℃保存。 商品化一抗或自制一抗均需加入防腐劑,在 4℃ 中保存一年其質(zhì)量不會(huì)有太多的改變,如一次購(gòu)置量大,可10μ l/支分裝,標(biāo)上號(hào), 40℃ 保存?zhèn)溆谩? 用抗體稀釋液稀釋一抗可在 4℃ 中保存一年。 八、顯示系統(tǒng)及襯染劑的選擇和配制 (一 )顯示系統(tǒng) 目前用于 IHC的標(biāo)記酶主要有 HRP,AKP,其顯示系統(tǒng)分別為: : (1) 3’二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽 (3’diaminbezidine。DAB)。 (2)3氨基 9乙基卡吧唑 (3amino9ethlylcarbazde。AEC)。 (3)四甲基聯(lián)苯胺; (4)鹽酸對(duì)苯二胺; (5)4氯 1萘酚; (6)高香草酸 (7) α –萘酚派若寧 : (1)BCIP( 5溴 4氯 3吲哚基磷酸 )+ NBT(硝基四氮唑藍(lán) ); (2) α –萘酚 ASBI磷酸鹽+快紅或快藍(lán)。 (1)DAB:50mg DAB溶在 100ml TrisHcl中,加入 % H2O2,顯色 8~ 12min,終產(chǎn)物為不溶性棕褐色顆粒狀。 (2)AEC:取 40mg AEC溶在 5ml二甲基甲酰胺中,待完全溶解后,加入 50ml,最后加入 % H2O,終產(chǎn)物為紅色可溶性。 (3)4氯 萘酚:取 100mg 4cl1萘酚溶于10ml無(wú)水乙醇中,待完全溶解后加入 TB 190ml,過(guò)濾后加入% H2O2。 (二 )襯染劑的選擇和配制 IHC染色后必須進(jìn)行襯染,以襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu),使形態(tài)與機(jī)能密切相關(guān),以利于結(jié)果的分析。 (1)Mayer氏蘇木素:取 1g Mayer氏蘇木素加溫溶于 100ml蒸餾水中,再加入 50g碘酸鈉和 50g鉀明礬,溶解后加入枸櫞酸和水合氯醛,溶解后過(guò)濾。 (2)Harris氏蘇木素:取 Harris氏蘇木素溶于 25ml無(wú)水乙醇中,另將鉀明礬加溫溶于 500ml蒸餾水中,待鉀明礬全部溶解,再將二液混合在一起,加入氧化汞,溶解 30min,冷卻后過(guò)濾,使用時(shí)加醋酸4ml,可增加染色強(qiáng)度。 : 取 2%甲基綠水溶液 20ml傾入潔凈的分液漏斗,加入三氯甲烷充分搖蕩混合,使甲基綠中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫紅色。旋動(dòng)分液漏斗下部的砂塞,移去紫紅色的三氯甲烷,如此反復(fù)更換氯仿,直到氯仿為無(wú)色。 : 取 100ml 15%硫酸鋁水溶液,加熱溶解,冷卻后過(guò)濾。 九、 IHC常用緩沖液: PBS TBS
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