【文章內容簡介】 有效期 抗體中非特異性蛋白質的含量 孵育時間長短 染色方法靈敏度差異*免疫組化染色的注意事項：抗體保存、配制 顯示劑合理使用 對照設計 結果判斷等免疫熒光組織化學技術的基本原理：是根據(jù)抗原抗體反應的原理，將已知的抗體與熒光素結合，以此標記的抗體與細胞或組織中的抗原結合，形成抗原抗體復合物，通過熒光顯微鏡激發(fā)光的照射，可使結合在抗原抗體復合物上的熒光素散發(fā)出熒光，從而可以對組織或細胞中的抗原進行檢測。免疫熒光組織化學技術的特點：特異性強、敏感性高、速度快。熒光：是指一個分子或原子吸收并儲存給予的能量后進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量以熒光形式釋放出來。熒光素：即一類天然／人工合成的有機化合物，在紫外光或短波照射下可發(fā)射熒光，這種能產生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素。自發(fā)熒光：是指組織（細胞）內少數(shù)成分未經熒光素染色，經短波照射便可發(fā)出熒光。繼發(fā)熒光：是指用能發(fā)光的色素（熒光素）染液或標記物標記的細胞成分所呈現(xiàn)的熒光。熒光效率：是指吸收光能轉變?yōu)闊晒獾陌俜謹?shù)，即發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強度）/吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）X 100%。熒光的淬滅：是指熒光物質的熒光輻射能力受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱的現(xiàn)象。熒光壽命：是指熒光物質被一瞬時光脈沖激發(fā)后產生的熒光隨時間而衰減到一定程度時所用的時間。用于標記的熒光素必須具備的條件：與蛋白質分子形成共價鍵的化學基團，結合后不易離解 未結合的色素與降解產物易排除 被標記后的結合物，不影響抗體效價，不影響熒光強度 熒光色素所發(fā)熒光與組織內自發(fā)熒光易于區(qū)別 制備方法簡便、快速 安全、無毒、性能穩(wěn)定、能長期保存、價廉免疫熒光染色方法的缺點：需特殊的熒光顯微鏡 熒光素易淬滅，標記切片不能保存過久，因而不能反復檢測 熒光染色常需新鮮組織，冷凍切片，故不能進行回顧性研究 組織內常有自發(fā)熒光出現(xiàn)，干擾標記切片的觀察免疫熒光染色的注意事項：標本：以新鮮未固定組織為好，切片要薄 固定液：中性福爾馬林固定時間24h，溫度要低 包埋：溫度絕不能60℃，使用低熔點石蠟（52℃） 脫蠟：脫蠟充分，玻片要清潔 染色：防抗體干，漂洗徹底 封固：緩沖甘油溶液或聚乙烯醇－緩沖甘油混合液 熒光標本應避光、加蓋，檢查時間每次以12h為宜，集中檢查 保存４℃冰箱，短期（數(shù)天）熒光素的種類：異硫氰酸熒光素（FITC）、四甲基異硫氰酸羅達明（TRITC）以及四乙基羅達明（RB200）。親和細胞化學：利用兩種物質間的高度親和特性及其可標記性，將酶等標記物連接到親和物上，以對體內待檢物進行檢測的方法。*親和物質：是指一些具有雙價或多價結合能力的物質，不但親和物質之間有高度親和力，而且可與各種標記物如熒光素、酶、同位素、膠體金及鐵蛋白等結合，從而在細胞或亞細胞水平進行另一親和物質的定位、定量。*親和免疫組織化學的優(yōu)點：提高免疫組織化學定位的專一性 加強免疫組織化學染色的靈敏度，減少非特異性反應常用的親和物質：生物素(Biotin)與卵白素(Avidin) 葡萄球菌A蛋白(SPA)與免疫球蛋白IgG 植物凝集素(Lectin)與糖結合物常用親和物質的作用原理：@生物素與親和素：生物素和親和素分子具有高度親和力，生物素能通過單一的生化反應結合大分子成分；親和素可以和不同的標記物結合，親和素也可作為橋，同時連接不同的生物素化的分子如抗體、酶等。@葡萄球菌A蛋白與免疫球蛋白：SPA內含4個高度相似的Fc段結合區(qū)，即A、B、C、D區(qū)，能與多種哺乳動物血清中的IgG Fc段結合而產生沉淀，并能與多種標記物相結合，SPA 具有雙價結合能力。ABC法(AvidinBiotinperoxidase plex method)：是指將卵白素和生物素偶聯(lián)的過氧化物酶或堿性磷酸酶按一定比例組成卵白素生物素酶復合物(ABC復合物)，卵白素作為橋梁，與生物素標記抗體和生物素酶復合物連接，從而形成一種較大類似晶格的復合體，大大提高了免疫酶染色的靈敏度。標記卵白素生物素法 (Labeled avidinbiotin, LAB法)：是以標記的卵白素連接生物素化大分子的反應體系，先用活化生物素偶聯(lián)抗體，用酶標記卵白素，制備成生物素化抗體和酶標卵白素。橋式卵白素生物素法 (Bridged avidin biotin, BRAB法)：是指利用卵白素作為橋梁，聯(lián)結生物素偶聯(lián)物質和生物素化的酶的方法，即用生物素分別標記抗體和酶，利用卵白素作為橋梁，將酶連接到特異性抗體 卵白素生物素系統(tǒng)的評價：敏感性高、特異性強、方法簡便、具有多功能性、應用范圍廣。內源性生物素消除方法：根據(jù)一個生物素分子只有一個位點能與卵白素結合的原理，在ABC染色前，%的卵白素處理標本20分鐘，%的生物素作用20分鐘。卵白素與內源性生物素已結合，從而阻斷了內源性生物素的活性，再加入生物素與前面的卵白素結合封閉其所有的結合點，由于組織中所有的生物素已和卵白素結合，因此不能再與ABC中的卵白素發(fā)生反應。免疫膠體金技術：以膠體金為標記物應用在免疫組織化學研究中，對細胞表面或細胞內的多糖、糖蛋白、蛋白質、多肽、激素和核酸等生物大分子進行定位研究。膠體金：又稱金溶膠，是一種物質以1 100 nm大小的粒子分散在另一物質中所形成的體系。膠體金制備的原理：采用化學還原法，即在氯化金水溶液中加入一定量的還原劑，使金離子還原為金原子。在適當條件下，還原的金原子凝聚成一定大小的金顆粒，形成金溶膠。影響溶膠穩(wěn)定性的因素：電解質、膠體金濃度、溫度、大分子物質。制備膠體金的注意事項：玻璃器皿的清潔：玻璃器皿清洗→清潔液浸泡24h →流水沖→蒸餾水反復洗滌→晾干 試劑的配制：應盡量使用分析純試劑，各種水溶液必須用三蒸水或去離子水配制 影響膠體金顆粒大小的因素：加入還原劑的速度、攪拌是否均勻、制備膠體金所用的燒瓶大小、加溫至100176。C時間超過15min或保存時間太長。膠體金標記前的準備工作：包括膠體金探針的制備以及膠體金蛋白質最佳結合率的測定。在標記之前需將膠體金的PH值調至待標蛋白質的等電點或略偏堿處，待標記的蛋白質也需要透析除鹽及離心去除蛋白質聚合物等沉淀。免疫膠體金染色方法的基本原理：@免疫金染色法（IGS法）： 直接法將膠體金標記的一抗直接對標本進行染色,然后在光鏡或電鏡下觀察 間接法先將未標記的特異性一抗與標本中的抗原結合，然后加金標二抗或SPA與一抗結合，在光鏡或電鏡下對抗原的分布進行定位研究。 @免疫金銀染色法（IGSS法）：經免疫反應沉積在抗原位點處的膠體金顆粒作為一種催化劑，在對苯二酚存在的情況下，將顯影液中的銀離子催化還原成銀原子，可將抗原位點清楚顯示出來。免疫膠體金染色方法的特點：膠體金制備簡便 標記簡單 特異性強 敏感性高 定位準確 6.