【文章內(nèi)容簡介】 水沖洗，系列乙醇浸泡，涼干涂膠，如需開展原位雜交，還需將玻片 240℃ 烤 2h。 (2)切片粘合劑的種類 多聚賴氨酸（分子量 300KD）： %濃度。 APES試劑（ 3氨基、丙基三氧基硅烷）：干凈載玻片 → 丙酮 5min →APES （ 1ml+50ml丙酮）：用鑷子夾住浸入 APES試劑 1～ 3次 → 純丙酮洗二次→ 干燥玻片 → 用鋁箔包好，室溫或 4℃ 保存?zhèn)溆谩? 鉻礬明膠液： 鉻礬 明膠 5g H2O2 1000ml 甲醛明膠液： 40％甲醛 明膠 H2O2 100ml ： ： IHC冰凍切片， ISH冰凍切片 (恒冷箱冰凍切片機和開放式冰凍切片機 ) ： (1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下 1/3。 (2)52－ 60℃ 烤片 18h。 (3)切片厚 2～ 4μ m。 (4)切片刀要快 (5)編上號 (6)切片可在 4℃ 保存數(shù)年（石蠟切片） (7)冰凍切片后需涼干后立即固定 (8)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組 織需經(jīng)庶糖處理 24h，冰凍切片。 (9)冰凍切片固定后 80℃ 保存?zhèn)溆? 八、組織與細胞材料的保存 ： 80℃ ， 145℃ ， 198℃ 組織應在離體 30min內(nèi)，快速取材，放入專用冷凍管中，并編上號，登記在冊。 ，裝入凍存管 中， 80℃ 凍存。 可根據(jù)需要將細胞直接培養(yǎng)在蓋玻片上， 9孔板上的細胞可經(jīng)固定后 80℃ 保存?zhèn)溆茫笕萘颗囵B(yǎng)的細胞收集凍存在液氮中。 第二部分 IHC的一些基本技術 主要內(nèi)容 一、實驗的設計 二、石蠟切片的脫蠟至水 三、內(nèi)源性酶的消除方法 四、 IHC的非特異性染色 五、抗原的暴露和修復 六、抗體的購置及注意事項 七、抗體最佳稀釋度的測定和保存 八、顯示系統(tǒng)及襯染劑的選擇和配制 九、 IHC常用緩沖液 一、實驗的設計 ，列出要做的IHC指標，根據(jù)經(jīng)費情況，選擇相關公司購置特異性抗體和檢測試劑。 IHC實驗操作流程，選擇何種 IHC前 處理方式。 ， 應設置何種對照。 ，孵育 時間和溫度，同一的顯色時間。 二、石蠟切片脫蠟至水 冰凍切片從 80℃ 取出，涼干或電吹風吹干后可直接進行免疫組化標記。石蠟切片需經(jīng)如下脫蠟才能做 IHC。 二甲苯 Ⅰ10min ，二甲苯 Ⅱ10min ，二甲苯 10minⅢ ，無水乙醇 2min， 95％乙醇 2min， 85％乙醇 2min， 75％乙醇2min，流水沖洗。 三、內(nèi)源性酶的消除方法 (一 )內(nèi)源性過氧化物酶的消除方法： 1. %～ 3%H2O2甲醇液 20min 2. 1％ H2O2 20min 3. 3％苯肼溶液 37℃ 1h 4. %鹽酸甲醇液 30min NaN3 硼酸鈉： %過碘酸 10min， 經(jīng)洗后 1％硼酸鈉處理 10min。 ～60min。 (二 )內(nèi)源性堿性磷酸酶的消除方法 1. 10％醋酸 10min 2. （ ） 20min 3. 1mol/L左旋咪唑 20min (三 )內(nèi)源性生物素的消除方法 2甲基 D苷露糖飽和生物素 25μ g/ml卵白素孵育 15min， PBS洗 10min，移至生物素飽和液中處理 15min，PBS洗 15min。 四、 IHC的非特異性染色 組織所帶電荷差異很大，可引起非特異染色。 解決方法： Fab切除 五、酶消化和抗原修復 ？ (1)固定液的影響 自 1893年 Ferdinand Blum創(chuàng)立組織固定以來，為了避免組織固定液對抗原決定簇的影響，已經(jīng)尋找到幾十種固定液，目的就是為了對一定抗原起到保護作用，同時還能獲得良好的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。 目前無一種固定液適用于所有的抗原，從組織細微結(jié)構(gòu)的保存，穩(wěn)定