【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ?試劑超過保質(zhì)期，建議實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)試劑的保質(zhì)期。 ?操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。 免疫組織化學(xué)常見問題分析 ?組織中無目的抗原的表達(dá)。 ?一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)一抗的種屬來源。 ?顯色物質(zhì)與 HRP系統(tǒng)不匹配，建議實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)顯色體系。 第十二頁，共三十五頁。 免疫熒光原理及特點(diǎn) 免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理及特殊的熒光素標(biāo)記技術(shù)，通過激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下觀察熒光的變化從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行分析的技術(shù)。用免疫熒光顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞〔或組織〕技術(shù)。 免疫熒光具有特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快等特點(diǎn)。 免疫熒光 〔 Immunofluorescence, IF〕 第十三頁，共三十五頁。 免疫熒光原理示意圖 第十四頁，共三十五頁。 免疫熒光實(shí)驗(yàn)過程 細(xì)胞爬片〔多聚賴氨酸處理，生長(zhǎng)密度 7080%〕 細(xì)胞固定〔適宜的固定液，如 4%甲醛溶液等〕 細(xì)胞膜穿透〔 Triton X100 等〕 封閉〔 3%BSAPBS等〕 一抗孵育 熒光二抗孵育 胞漿 /核襯染〔鬼筆環(huán)肽 /DAPI/PI〕 封片熒光顯微鏡拍照 第十五頁，共三十五頁。 免疫熒光結(jié)果分析 第十六頁，共三十五頁。 免疫熒光雙染色抗體的選擇 直接法： ?一抗種屬來源無要求 ?標(biāo)記兩種不同熒光素的一抗。 間接法： ?一抗種屬來源來源不同 ?二抗分別標(biāo)記不同熒光素。 第十七頁，共三十五頁。 細(xì)胞核襯染染料： DAPI是一種能夠與 DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料它可以透過完整的細(xì)胞膜，因此以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。最大吸收波長(zhǎng)為 358nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 461nm，其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。 Hoechst 33342 是一種 DNA結(jié)合型熒光染料 ,可以嵌合到堿基分子中 ,在紫外激發(fā)光作用下發(fā)出蘭色熒光 .能夠透過完整的細(xì)胞膜，可用于活細(xì)胞染色。 碘化丙啶 (PI)是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈 DNA后釋放紅色熒光。盡管 PI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。 PIDNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為 535nm和 615nm。 細(xì)胞漿襯染染料： 鬼筆環(huán)肽〔 phalloidin 〕由鬼筆鵝膏真菌〔 Amanita phalloides〕產(chǎn)生的一種環(huán)肽?？膳c F肌動(dòng)蛋白結(jié)合，使 F肌動(dòng)蛋白保持穩(wěn)定。其熒光標(biāo)記物是鑒定 F肌動(dòng)蛋白的重要試劑。 熒光抗體的選擇： 綠色熒光素： FITC， Alex488， Dylight488等。 紅色熒光素： PE， Alex546等。 各種熒光染料原理及選擇 第十八頁，共三十五頁。 無目的蛋白或表達(dá)量極少，建議選用表達(dá)量高的細(xì)胞或組織。 細(xì)胞通透性差，建議增加通透劑的作用時(shí)間或濃度。 一抗 /二抗?jié)舛忍?，建議增大其濃度。 二抗選擇錯(cuò)誤〔種屬不匹配〕，建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。