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免疫組化、免疫熒光、流式細胞術(shù)的應(yīng)用比較及常見問題分析(編輯修改稿)
2024-10-03 13:52
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【文章內(nèi)容簡介】 ?試劑超過保質(zhì)期,建議實驗前確認(rèn)試劑的保質(zhì)期。 ?操作過程沖洗過度,建議適度沖洗。 免疫組織化學(xué)常見問題分析 ?組織中無目的抗原的表達。 ?一抗種屬來源與二抗不匹配,建議實驗前確認(rèn)一抗的種屬來源。 ?顯色物質(zhì)與 HRP系統(tǒng)不匹配,建議實驗前確認(rèn)顯色體系。 第十二頁,共三十五頁。 免疫熒光原理及特點 免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理及特殊的熒光素標(biāo)記技術(shù),通過激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光,在熒光顯微鏡下觀察熒光的變化從而對細胞內(nèi)的抗原進行分析的技術(shù)。用免疫熒光顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞〔或組織〕技術(shù)。 免疫熒光具有特異性強、敏感性高、速度快等特點。 免疫熒光 〔 Immunofluorescence, IF〕 第十三頁,共三十五頁。 免疫熒光原理示意圖 第十四頁,共三十五頁。 免疫熒光實驗過程 細胞爬片〔多聚賴氨酸處理,生長密度 7080%〕 細胞固定〔適宜的固定液,如 4%甲醛溶液等〕 細胞膜穿透〔 Triton X100 等〕 封閉〔 3%BSAPBS等〕 一抗孵育 熒光二抗孵育 胞漿 /核襯染〔鬼筆環(huán)肽 /DAPI/PI〕 封片熒光顯微鏡拍照 第十五頁,共三十五頁。 免疫熒光結(jié)果分析 第十六頁,共三十五頁。 免疫熒光雙染色抗體的選擇 直接法: ?一抗種屬來源無要求 ?標(biāo)記兩種不同熒光素的一抗。 間接法: ?一抗種屬來源來源不同 ?二抗分別標(biāo)記不同熒光素。 第十七頁,共三十五頁。 細胞核襯染染料: DAPI是一種能夠與 DNA強力結(jié)合的熒光染料它可以透過完整的細胞膜,因此以用于活細胞和固定細胞的染色。最大吸收波長為 358nm,最大發(fā)射波長為 461nm,其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。 Hoechst 33342 是一種 DNA結(jié)合型熒光染料 ,可以嵌合到堿基分子中 ,在紫外激發(fā)光作用下發(fā)出蘭色熒光 .能夠透過完整的細胞膜,可用于活細胞染色。 碘化丙啶 (PI)是一種溴化乙啶的類似物,它在嵌入雙鏈 DNA后釋放紅色熒光。盡管 PI不能通過活細胞膜,但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色。 PIDNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為 535nm和 615nm。 細胞漿襯染染料: 鬼筆環(huán)肽〔 phalloidin 〕由鬼筆鵝膏真菌〔 Amanita phalloides〕產(chǎn)生的一種環(huán)肽。可與 F肌動蛋白結(jié)合,使 F肌動蛋白保持穩(wěn)定。其熒光標(biāo)記物是鑒定 F肌動蛋白的重要試劑。 熒光抗體的選擇: 綠色熒光素: FITC, Alex488, Dylight488等。 紅色熒光素: PE, Alex546等。 各種熒光染料原理及選擇 第十八頁,共三十五頁。 無目的蛋白或表達量極少,建議選用表達量高的細胞或組織。 細胞通透性差,建議增加通透劑的作用時間或濃度。 一抗 /二抗?jié)舛忍?,建議增大其濃度。 二抗選擇錯誤〔種屬不匹配〕,建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。
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