【正文】 的，人們不可能將其完全模擬出來，因而，可以說，在可預(yù)見的未來人類是不可能將所有的微生物都轉(zhuǎn)變成可培養(yǎng)的。 稀釋培養(yǎng) 地球上廣泛分布著長期適應(yīng)貧營養(yǎng)環(huán)境的細(xì)菌。此類細(xì)菌對(duì)過高的鹽類和有機(jī)物敏感，營養(yǎng)基質(zhì)會(huì)造成它們復(fù)蘇障礙，由于常規(guī)培養(yǎng)方法使用的高濃度營養(yǎng)基質(zhì)不利于微生物生長，所以適當(dāng)降低營養(yǎng)基質(zhì)的濃度可以減弱這種不利影響。Franklin[88]采用從原液到104濃度進(jìn)行系列稀釋培養(yǎng)方法來分析和重建一個(gè)污水微生物群落，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)稀釋梯度都會(huì)新分離到2～3個(gè)獨(dú)特的類群。Connon[89]提出高通量培養(yǎng)法(Highthroughput culturing， HTC)。將樣品稀釋至痕量后，采用小體積48孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離培養(yǎng)微生物。該方法不僅有效提高微生物的可培養(yǎng)性，還可在短期內(nèi)監(jiān)測大量的培養(yǎng)物，大大提高工作效率。Cho[90]等利用該方法從太平洋近海和遠(yuǎn)洋海水中也分離出多種新菌。 分散培養(yǎng) 自然界中很多微生物聚集生長，形成“絮體”和“顆粒”等，致使其內(nèi)部的微生物接觸不到培養(yǎng)基而不易被培養(yǎng)。如在培養(yǎng)之前對(duì)“絮體”和“顆粒”等進(jìn)行適度的超聲處理，使細(xì)胞在分散后進(jìn)行培養(yǎng)，就可能會(huì)使更多的微生物被培養(yǎng)分離[91] 。 延長培養(yǎng)時(shí)間 對(duì)“寡營養(yǎng)菌”的培養(yǎng)，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間，使其能長至肉眼可見的尺度。Janssen .[91]等通過實(shí)驗(yàn)證明培養(yǎng)時(shí)間在12周時(shí)平板上的數(shù)量會(huì)達(dá)到最多，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移所要求的無菌環(huán)境也應(yīng)該提高，且平板還要防干裂[92]。 未培養(yǎng)微生物的非培養(yǎng)研究方法 當(dāng)前，探索未培養(yǎng)微生物的研究方法已作為微生物學(xué)的一個(gè)新挑戰(zhàn)，成為未培養(yǎng)微生物研究的技術(shù)瓶頸，受到極大的關(guān)注。近年來，對(duì)于研究環(huán)境微生物的種類和數(shù)量，發(fā)展了生物化學(xué)[93]、生理學(xué)[94]和分子生物學(xué)[95,96]等不需傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，如：核酸指紋圖譜法和宏基因組技術(shù)。他們能夠克服微生物培養(yǎng)技術(shù)的限制，能對(duì)樣品進(jìn)行較客觀的分析，能夠較精確地揭示微生物種類和遺傳的多樣性，能夠獲得可供人類開發(fā)利用的豐富多樣的新基因資源。宏基因組技術(shù)可以提供比可培養(yǎng)微生物大得多的遺傳信息，Streit等認(rèn)為這對(duì)研究未培養(yǎng)微生物是關(guān)鍵的方法[97]，是一項(xiàng)很有前途的生物學(xué)技術(shù)[65]。雖然非培養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展，但是純培養(yǎng)技術(shù)依然不可替代。因?yàn)椤拔⑸飳W(xué)是關(guān)于有機(jī)體的科學(xué)”。利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定的類群為數(shù)巨大，對(duì)于這些類群的形態(tài)、生理代謝、遺傳和生態(tài)功能等方面的知識(shí)難以通過實(shí)驗(yàn)研究而僅是靠推測獲得，更談不上獲取有用的代謝產(chǎn)物發(fā)展生物技術(shù)了。因此，分子生物學(xué)資料應(yīng)只是其它信息(如表型)的補(bǔ)充而不是完全替代。對(duì)于環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的研究必將是以獲得純菌株為最終目的?？偨Y(jié)由于微生物群落及其生存環(huán)境的復(fù)雜性，在任何情況下試圖提高微生物的可培養(yǎng)性都不能僅局限于一種或幾種方法，而應(yīng)綜合采用多種有效的方法。另一方面，還應(yīng)在發(fā)展微生物培養(yǎng)技術(shù)同時(shí)，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，使兩種方法相輔相成，更好地提高微生物的可培養(yǎng)性，如Rapp233。和Connon[98]結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，對(duì)高通量培養(yǎng)法進(jìn)行了改進(jìn)，根據(jù)從培養(yǎng)板各孔中針對(duì)性地檢測SAR11進(jìn)化分支的海洋細(xì)菌的存在，在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行了大量的培養(yǎng)?？膳囵B(yǎng)性本身不是細(xì)菌細(xì)胞的特性[99]。在一定程度上，微生物能否被培養(yǎng)取決于是否找到了適宜的培養(yǎng)方法，也有報(bào)道認(rèn)為在某些環(huán)境甚至70%左右的細(xì)胞是可以培養(yǎng)的[100]。所以，只要微生物學(xué)家和生物技術(shù)學(xué)家勇于迎接挑戰(zhàn)、不斷地深入研究，增強(qiáng)微生物的可培養(yǎng)性、把更多未培養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)變成為可培養(yǎng)仍然是一件大有可為的工作。四、微生物分類鑒定的研究方法微生物分類鑒定方法包括表型鑒定法和分子遺傳學(xué)鑒定法兩大類，分成4個(gè)水平：細(xì)菌形態(tài)和生理生化水平、細(xì)胞組分水平、蛋白質(zhì)分析水平和核酸分析水平。表型鑒定法是對(duì)前3個(gè)水平的鑒定，包括常規(guī)鑒定法、數(shù)值分類鑒定法和化學(xué)分類鑒定法。分子遺傳學(xué)鑒定法[101]是核酸水平的鑒定，對(duì)細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析，包括G+Cmol%含量測定、核酸雜交、PCR技術(shù)、16SrRNA和16～23SrRNA序列分析、全基因組測序等，此類方法使細(xì)菌種屬定位和親源關(guān)系判別由表型特征深化為基因型鑒定。經(jīng)典分類鑒定法經(jīng)典分類法是一百多年來進(jìn)行微生物分類的傳統(tǒng)方法，是最常用、最重要的分類鑒定指標(biāo)，也是任何現(xiàn)代化分類鑒定方法的基本依據(jù)。其分類鑒定的主要依據(jù)是形態(tài)學(xué)特征、生理生化反應(yīng)特征、生態(tài)學(xué)特征以及血清學(xué)反應(yīng)、對(duì)噬菌體的敏感性等。一般在科以上分類單位以形態(tài)特征、科以下分類單位以形態(tài)結(jié)合生理生化特征加以區(qū)分。 現(xiàn)代分類鑒定方法 數(shù)值分類法數(shù)值分類法又稱統(tǒng)計(jì)分類法，近20年來發(fā)展起來的細(xì)菌分類理論，依據(jù)數(shù)值分析的原理，借助現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)擬分類的微生物對(duì)象按大量表型性狀的相似性程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、歸類的方法。數(shù)值分類得到的是表觀群，相關(guān)系數(shù)小者為同屬，相關(guān)系數(shù)大者為同種，實(shí)踐證明，表觀群是等同于分類單元的。大約是 75%相似度的表觀群可視為同一種，比值達(dá)65%以上者可歸入同一屬。這樣的結(jié)論和傳統(tǒng)分類方法的結(jié)果通常是一致的。數(shù)值分類法的優(yōu)越性[102]在于它是以分析大量分類特征為基礎(chǔ)，對(duì)于類群的劃分比較客觀和穩(wěn)定；而且促進(jìn)對(duì)細(xì)菌類群的全面考查和觀察，為細(xì)菌的分類鑒定積累大量資料。但在使用數(shù)值分類法對(duì)細(xì)菌菌株分群歸類定種或定屬時(shí)，還應(yīng)做有關(guān)菌株的 pNA堿基的（G+C)mol%和DNA雜交，以進(jìn)一步加以確證。 化學(xué)分類鑒定法根據(jù)微生物細(xì)胞的特征性化學(xué)組分對(duì)微生物進(jìn)行分類的方法稱化學(xué)分類法（chemotaxonomy）。細(xì)胞化學(xué)成分鑒定主要包括以下幾個(gè)方面：細(xì)胞壁的化學(xué)組成、全細(xì)胞水解液的糖型、磷酸類脂的成分分析、枝菌酸的分析、醌類的分析、全蛋白組分分析。其中革蘭氏陽性細(xì)菌的肽聚糖、胞壁單糖、細(xì)胞膜磷酸類脂、異戊二烯醌和全細(xì)胞脂肪酸的分析；革蘭氏陰性細(xì)菌的異戊二烯醌和全細(xì)胞脂肪酸的分析，在細(xì)菌屬和屬以上分類單元系統(tǒng)分析中幾乎已經(jīng)成為不可或缺分類鑒定手段。此外某些細(xì)菌原生質(zhì)膜中的異戊間二烯醌、細(xì)胞色素、以及紅外光譜等分析對(duì)于細(xì)菌、放線菌中某些科、屬、種的鑒定也都十分有價(jià)值。 遺傳學(xué)分類法DNA是除少數(shù)RNA病毒以外的一切微生物的遺傳信息載體。每一種微生物均有其自己特有的、穩(wěn)定的DNA即基因組的成分和結(jié)構(gòu)，不同種微生物間基因組序列的差異程度代表著它們之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近、疏密。因此每種微生物DNA的若干代表性數(shù)據(jù)，對(duì)微生物的分類和鑒定工作極為重要。 DNA堿基比例的測定——（G+C）mol%值 （G+C）mol%值簡稱“GC比”，表示DNA分子鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的摩爾百分比，它是目前發(fā)表任何微生物新種時(shí)所必須具有的重要指標(biāo)。每個(gè)生物種都有特定的GC%范圍，因此可利用（G+C）mol%來鑒別各種微生物種屬間的親緣關(guān)系及其遠(yuǎn)近程度。包括紙層析法、浮力密度法、高效液相色譜法[103]、熱變性溫度(Tm)[104]法和熒光法等。一般認(rèn)為任何兩種微生物在（G+C）含量上的差別超過10%，這兩種微生物就肯定不是同一個(gè)種。值得注意的是，親緣關(guān)系相近的菌，其（G+C）mol%含量相同或者近似，但（G+C）mol%相同或近似的細(xì)菌，其親緣關(guān)系并不一定相近，這是因?yàn)檫@一數(shù)據(jù)還不能反映出堿基對(duì)的排列序列。要比較兩種細(xì)菌的DNA 堿基對(duì)排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸雜交試驗(yàn)。 核酸分子雜交 不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關(guān)系就越近，反之亦然。核酸雜交技術(shù)[105, 106]根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，將2條不同來源的單鏈核酸進(jìn)行復(fù)性以鑒定菌株間的親源關(guān)系，用于DNADNA(Southern雜交)、DNARNA、RNARNA(Northern雜交)和PNADNA雜交(PNA為肽核酸)。其是比上述GC比更細(xì)致和更精確的遺傳性狀指標(biāo)。DNADNA雜交適用于種水平的研究，而DNArRNA雜交用于屬和屬以上水平的分類研究。一般認(rèn)為核酸雜交同源性小于20%為不同菌屬，20%～60%為屬內(nèi)緊密相關(guān)的種，60%～70%為同種內(nèi)不同亞種，大于70%為同一亞種[107]。 16SrRNA同源性分析 16SrRNA為細(xì)胞所共有，分子量大小適中，便于序列分析，其功能同源且最為古老，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。保守性反映生物物種的親源關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育提供線索；高變性則揭示生物物種的特征核酸序列，是種屬鑒定的分子基礎(chǔ)，其序列變化與進(jìn)化距離相對(duì)應(yīng)，在細(xì)菌種屬分類鑒定中廣泛應(yīng)用。16SrRNA[108]序列分析是一種非培養(yǎng)分析技術(shù)，能快速鑒定目前尚不能人工培養(yǎng)的微生物。若兩菌的16SrRNA同源性大于99%，且染色體DNA雜交率大于70%，基因水平上為同一種細(xì)菌。多相分類多相分類（polyphasic taxonomy）的概念最初由Colwell 于1970年提出，指利用微生物多種不同的信息，包括表型的、基因型的和系統(tǒng)發(fā)育的信息，綜合起來研究微生物分類和系統(tǒng)進(jìn)化的過程。多相分類幾乎包括了現(xiàn)代分類中所有方面，如傳統(tǒng)分類、化學(xué)分類、分子分類、數(shù)值分類等，被認(rèn)為是目前研究各級(jí)分類單位的最有效手段，可用于所有水平上的分類單位的描述和定義。參考文獻(xiàn)[1] 周麗霞,丁明懋. 土壤微生物學(xué)特性對(duì)土壤健康的指示作用. 生物多樣性, 2007, 15(2): 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