【正文】 DNA 組成，而且由于限制性內(nèi)切酶識別序列具有專一性，所以用 RFLP 技術(shù)進行多態(tài)性分析具有較高的可靠性；(2)運用該技術(shù)時所涉及的遺傳信息較多，區(qū)分種群差異的能力更強，因此該方法對微生物群落多樣性，尤其是微生物的分類和鑒定具有重要意義[37, 38] 。該技術(shù)是Bostein首先提出的一種分子遺傳標記，是第一代以DNA指紋圖譜為基礎(chǔ)用于微生物分型鑒定的方法。因此，大量基于16SrRNAPCR的分子微生物學(xué)方法被發(fā)展應(yīng)用于復(fù)雜的微生物生態(tài)研究，為微生物群落多樣性提供了圖案或輪廓，分析時有直觀、快速、高通量的特點。 基于PCR技術(shù)的DNA指紋圖譜技術(shù)PCR技術(shù)是1985年由Mullis發(fā)明的一種聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)，主要特點是短時間內(nèi)能在實驗室條件下人為地控制并特異擴增目的基因或DNA片段，使研究的目的基因及樣品中的微量微生物基因得到擴增，為分子微生物生態(tài)學(xué)的研究提供了非常方便的手段。FISH技術(shù)的應(yīng)用受到環(huán)境樣品微生物生理狀態(tài)的影響，芽孢、放線菌及休眠時期的細胞的細胞膜的通透性低，會影響群落中部分種屬豐度的錯誤估計。這項技術(shù)最早應(yīng)用是放射性的互補序列作探針對DNA靶序列進行研究。由于雜交的是細胞，所以不需要提取DNA，進行PCR擴增以及克隆等步驟。該方法中，整個細胞是被固定的。熒光原位雜交技術(shù)就像Northern、Southern印記一樣，是基于兩個寡核苷酸通過互補序列配對。分子生物學(xué)研究方法 基于分子雜交技術(shù)的分子標記法熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù) 環(huán)境樣品直接作原位雜交(in situ hybridization)，可以得到未知菌的微生物多樣性的大量信息，如微生物的形態(tài)特征和豐度及在樣品上的空間分布和動態(tài)，原位雜交技術(shù)能有效對環(huán)境微生物的樣品進行定量。第一，他不能從種的水品上鑒定微生物，只能鑒定到屬；第二，這種方法依賴于標記脂肪酸，標記脂肪酸變化導(dǎo)致錯誤的群落變化估計，因此操作過程需要十分小心謹慎，防止人為因素的干擾。因此，許多研究者用包括土壤在內(nèi)的環(huán)境樣中可提取磷脂類化合物中的脂肪酸(PLFA)組成來直接估價其微生物的群落結(jié)構(gòu)[30, 31]。一些學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)使用直接從土壤中提取的磷脂類化合物的量可準確地表達為土壤的微生物量[31]。使用磷脂類化合物中的脂肪酸組成估價土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)是近幾十年常用的一種生化方法。磷脂脂肪酸圖譜分析法的基本流程是:首先將磷脂脂肪酸全部提取出來，然后用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用進行分析，得出PLFA圖譜[29]。即使存在以上缺點，但由于可以快速、簡便地獲得大量土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性方面的信息，仍被認為是一種較好的方法。但BIOLOG只能反映少數(shù)適合在微平板(microplate)培養(yǎng)基上生長的微生物，即通過微生物群落對選擇性培養(yǎng)基或刺激物的反應(yīng)來測定代謝活性，所以不能反映實際狀態(tài)[28]。Biolog 法被用于多種病原微生物的鑒定和環(huán)境微生物群落的研究中。此方法是根據(jù)微生物對單一碳源底物的利用能力差異，當接種菌懸液時，其中一些孔中的營養(yǎng)物質(zhì)被利用，使孔中的氧化反應(yīng)指示劑四氯唑紫呈現(xiàn)不同程度的紫色，從而構(gòu)成該微生物的特定指紋。但這種方法適合分離具有特定功能的特殊目標物種，利用該方法已獲得許多應(yīng)用價值的微生物種類，并應(yīng)用于基因介導(dǎo)及生態(tài)恢復(fù)等方面。由于傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法只能反應(yīng)極少數(shù)微生物的信息，這些結(jié)果不但不能充分反映土壤微生物生態(tài)功能，而且還埋沒了大量極有應(yīng)用價值的微生物資源。純培養(yǎng)方法和原理大多數(shù)是從研究有關(guān)醫(yī)用微生物的方法中引用過來的，其實有些方法對土壤微生物研究并不適合。傳統(tǒng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)中，微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)的分析大部分僅局限于從固體培養(yǎng)基上分離的微生物，隨著人們對土壤中微生物原位生存環(huán)境的研究，發(fā)現(xiàn)這種傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法其實很難全面地估價微生物群落多樣性。生物或化學(xué)的研究方法 傳統(tǒng)的平板計數(shù)法平板計數(shù)法是利用一定的培養(yǎng)基和方法選擇所特定的微生物，再根據(jù)各種微生物的生理生化特征及外觀形態(tài)等方面進行分析鑒定。二是基于PCR技術(shù)的研究方法，這些方法可以將極微量的DNA進行大量擴增，通過分析基因序列的特異性研究土壤微生物的多樣性。根據(jù)研究技術(shù)類型，土壤微生物多樣性的研究方法大體上可分為兩類：基于生物或化學(xué)的方法和基于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的方法[14]。其次，土壤微生物種質(zhì)資源在修復(fù)污染環(huán)境方面也起著很重要的作用，特別在土壤修復(fù)、水體治理、固廢處理過程中起著關(guān)鍵性作用，利用微生物分解有毒有害物質(zhì)的生物修復(fù)技術(shù)被公認為治理大面積污染區(qū)域的一種有價值的方法。　土壤微生物的生態(tài)安全調(diào)控機能土壤質(zhì)量是指土壤容納和凈化污染物質(zhì)、維護和保障綠色植物生長以及滿足人類其他合理需求的綜合能力量度[20]，而土壤微生物在維護土壤健康、保障土壤可持續(xù)利用和調(diào)控生態(tài)安全等方面都發(fā)揮著重要的作用。C、N、P、S的循環(huán)受2個主要的生物過程控制，一是光合生物對無機營養(yǎng)物的同化，二是后來進行的有機物的生物礦化。生命物質(zhì)的主要組成元素(C、H、O、N、P、S)循環(huán)很快，少量元素(Mg、K、Na、鹵族元素)和微量元素(Al、Co、Cr、Cu、Mo、Ni、Se、V、Zn)則循環(huán)緩慢。若沒有微生物，地球上的動植物殘體將堆積如山，長期存留于人類生存的環(huán)境中，生物所需的各種營養(yǎng)元素終將消耗殆盡，人類社會勢難世代綿延向前發(fā)展[13]。絕大多數(shù)微生物作為異養(yǎng)生物，它們分解生物圈內(nèi)存在的動物、植物和微生物的殘體以及各種復(fù)雜有機物質(zhì)，吸收一些分解產(chǎn)物，最終將有機物分解成簡單的無機物，而這些無機物又可以被初級生產(chǎn)者利用，再次參與物質(zhì)循環(huán)。本文著重從有機物分解、物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)安全調(diào)控等3個角度，簡要的介紹了土壤微生物多樣性的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能。土壤微生物多樣性影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能及過程，是維持土壤生產(chǎn)力的重要組分，也是評價自然或人為干擾引起土壤質(zhì)量變化的重要指標。由于微生物具有多種多樣的代謝方式和生理功能，所以可以適應(yīng)各種不同的生態(tài)環(huán)境，并以不同的生活方式與其他生物相互作用，從而構(gòu)成地球上豐富多彩的生態(tài)體系。生物多樣性豐富的土壤，生態(tài)功能也呈現(xiàn)多樣性，其生態(tài)系統(tǒng)和生產(chǎn)力均保持穩(wěn)定[18]。若利用率越高，維持相同微生物生物量所需要的能源就越少，說明土壤環(huán)境有利于土壤微生物的生長，土壤質(zhì)量就比較高；土壤微生物具有提高土壤肥力的生態(tài)功能。土壤是微生物的生活場所，土壤的通氣性、水分狀況、養(yǎng)分狀況以及有機質(zhì)含量都直接影響著土壤微生物的種類和數(shù)量。 土壤微生物的功能多樣性土壤微生物的功能多樣性是指土壤微生物群落所能執(zhí)行的功能范圍和這些功能的執(zhí)行過程，如分解功能、營養(yǎng)傳遞功能以及促進或抑制植物生長的功能等等，這些功能對土壤生態(tài)功能及自然界元素循環(huán)有著重要意義。例如，微生物標記物分析法通過提取和分析微生物群落中可以用作不同類群標記性指紋的生化組分或胞外產(chǎn)物來獲取微生物群落組成和結(jié)構(gòu)多樣性的信息[15]。該數(shù)據(jù)庫正在不斷擴大，目前已有足夠大的數(shù)據(jù)庫對微生物進行系譜分類。保守區(qū)內(nèi)核苷酸序列恒定，在分類上相距遠的微生物分類群之間才有差異；變異區(qū)能夠顯示微生物分類種的差異；因而SSU rDNA被用于對微生物進行系譜分類。在微生物多樣性研究中，人們最感興趣的是小亞基RNA或其編碼基因SSU rDNA。與高等生物相比，微生物的多樣性在基因水平上更為突出，不同種群間的遺傳物質(zhì)和基因表達具有很大的差異[13]。這就迫切要求人們在研究方法和研究技術(shù)上的進步。1995年Amann等根據(jù)在原位、無培養(yǎng)的微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，認為地球上僅細菌就有10～50萬種，然而自然界中95%～99%的微生物種群卻因為當前研究方法的局限還未被分離培養(yǎng)和描述[12]。因為微生物形態(tài)簡單、易變，不像動、植物那樣有足夠而又穩(wěn)定的形狀可用于分類鑒定，這也限制了物種多樣性的研究。這是因為微生物與高等生物不同，在高等生物中可用于定義種的幾個主要性狀，在微生物中無法使用，這是由于原核微生物本身的生理和形態(tài)特點決定的。對于微生物而言，物種的分類鑒定存在著極大的困難，因而也就在很大程度上限制了微生物多樣性的研究。因而，開展土壤微生物多樣性研究技術(shù)難度較大、方法要求較高，當前主要集中在物種多樣性、遺傳多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性及功能多樣性等4個水平。因此我們認為，土壤微生物多樣性研究的核心內(nèi)容應(yīng)是自然或干擾條件下土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)、種群消長、生理代謝、遺傳變異及其演替規(guī)律，尤其是環(huán)境變更或管理分異條件下土壤質(zhì)量的微生物學(xué)監(jiān)測、評價與調(diào)控，及土壤微生物種質(zhì)資源的開發(fā)與應(yīng)用。土壤微生物多樣性研究的內(nèi)容生態(tài)系統(tǒng)是指各種生物與其周圍環(huán)境所構(gòu)成的自然綜合體。生物多樣性還可以定義為生命的豐富度(richness of life)，通常以土壤生物區(qū)系的變化和生物化學(xué)過程間的相互貢獻來反映。土壤微生物多樣性的概念土壤微生物多樣性又稱微生物群落結(jié)構(gòu)，是指生命體在遺傳、種類和生態(tài)系統(tǒng)層次的變化[9]。英國自然與環(huán)境委員會(Natural Environment Research Council, NERC)于1999年啟動了土壤生物多樣性研究計劃，該計劃為期5a[8]。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的統(tǒng)計，在氮素固定、有機廢棄物處理、土壤形成、污染修復(fù)及農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治等方面，全球農(nóng)業(yè)土壤生物每年創(chuàng)造的總價值超過1542億美元。每克土壤中棲息著大約100億個微生物[3]，但在顯微鏡下觀察到的微生物不到1%可以培養(yǎng)[4]。本研究有以下3個內(nèi)容：1． 培養(yǎng)基類型對土壤細菌可培養(yǎng)和多樣性的影響2． 培養(yǎng)時間對土壤細菌可培養(yǎng)和多樣性的影響3． 對篩選分離的新菌的初步鑒定V第一章 文獻綜述第一章 文獻綜述一、土壤微生物的多樣性土壤微生物多樣性的重要性土壤生態(tài)系統(tǒng)是保證動植物生存、農(nóng)業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)[1]，對全球環(huán)境變化有著深遠的影響。本研究在傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上進行了改進，闡明培養(yǎng)基類型對土壤可培養(yǎng)細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，揭示培養(yǎng)時間對土壤可培養(yǎng)細菌數(shù)量與多樣性之間的關(guān)系?？膳囵B(yǎng)性本身不是細菌細胞的特性。近年來分子生物學(xué)研究技術(shù)等非可培養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展，極大地推動了自然界功能微生物資源的開發(fā)和利用，給微生物生態(tài)學(xué)的研究帶來了光明的前景，如RFLP， ALFP， RAPD和DGGE等方法已經(jīng)被應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究并表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢，結(jié)果更趨于真實，大量未被認知的微生物新物種及其新功能得到鑒定和應(yīng)用。但是大量的不可培養(yǎng)的微生物是傳統(tǒng)方法最大的弊端。 Incubation time。 Culturability。 knowledge level, 99% of the microorganisms in nature have not be cultured and isolated by traditional pure culture technique, so studies and developments are focused on the 99% of uncultured microorganisms at home and abroad. In this research, three culturing media were used for timeinterval counting of soil bacteria. Bacterial universal primers were used to amplify 16S rDNA fragments?；谝陨蠑?shù)據(jù)我們初步鑒定菌株TR611屬于Humihabitans屬的一個新種，并命名為Humihabitans sp. TR611。TR611的主要脂肪酸為C22:1 w7c/22:3 w3c，C24:2 w6c。TR611能產(chǎn)生H2S，能使明膠液化，能使淀粉水解，能使過氧化氫溶液產(chǎn)生小氣泡，能使硝酸鹽還原。TR611革蘭氏染色反應(yīng)呈陽性，細胞形態(tài)呈長桿狀，無鞭毛和菌毛，無運動能力，好氧；在GPM、NA培養(yǎng)基上長勢良好，最適生長溫度為30℃，%，無Nacl等鹽離子依賴性，最適pH值為6. 8。TR67的16S rDNA序列與其最相鄰Phycicoccus dokdonensis KCTC %。TR67能利用蔗糖、半乳糖、果糖、麥牙糖、山梨醇、阿拉伯糖、蜜三糖、核糖、乳糖、甘露糖、肌醇、葡萄糖、木糖為唯一碳源生長，但不利用甘露醇和甜醇。TR67革蘭氏染色反應(yīng)呈陽性，細胞形態(tài)呈橢圓狀，無鞭毛和菌毛；最適生長溫度為30℃，最適的鹽濃度為2%，無Nacl等鹽離子依賴性。結(jié)果表明，LB、CSEA、WSA培養(yǎng)基192 10107 CFU，但微生物多樣性指數(shù)以WSA為最高，LB多樣性指數(shù)最低；三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌菌群有一定的相似性，%，%，%；96～192 h細菌的豐富度最高，0～48 h細菌豐富度最低，%均是在96 h后才出現(xiàn)的。因此研究和開發(fā)這99%的未培養(yǎng)微生物已成為國內(nèi)外的一個熱點。培養(yǎng)方法對土壤可培養(yǎng)細菌多樣性的影響及兩株新菌的初步鑒定畢業(yè)論文目 錄摘要 IABSTRACT III符號與縮略語說明 VII前言 IX第一章 文獻綜述 1一、土壤微生物的多樣性 1二、土壤微生物多樣性的研究方法 4三、未培養(yǎng)微生物的研究進展 12四、微生物分類鑒定的研究方法 17參考文獻 20第二章 培養(yǎng)方法對土壤可培養(yǎng)細菌多樣性的影響 291 材料與方法 292 結(jié) 果 333 討 論 38參考文獻 40第三章 Phycicoccus sp. TR67的初步鑒定 431 材料與方法 432 結(jié)果與分析 503 結(jié)果討論 56參考文獻 58第四章 Humihabitans sp. TR611的初步鑒定 612 結(jié)果與分析 623 結(jié)果討論 66參考文獻 68全文總結(jié) 71創(chuàng)新之處 73附錄 I 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文 73附錄II 文中所用的培養(yǎng)基和試劑配方 75致 謝 77摘要培養(yǎng)方法對土壤可培養(yǎng)細菌多樣性的影響及兩株新菌的初步鑒定摘要提高土壤微生物的可培養(yǎng)性，獲得