【正文】 壤微生物的物種多樣性土壤微生物的物種多樣性是指一定區(qū)域內(nèi)物種的多樣性化及其變化，包括一定區(qū)域內(nèi)生物區(qū)系的狀況（如受威脅狀況和特有性等）、形成、演化、分布格局及其維持機(jī)制等，這是微生物多樣性的最直接表現(xiàn)形式。首先微生物種的概念較模糊，至今還找不到一個(gè)公認(rèn)的、明確的種的定義。其次，微生物的鑒定很難。第三，研究方法的局限。所以目前著重研究一些對(duì)人類關(guān)系最為密切的微生物種類，并通過培養(yǎng)基最大限度地培養(yǎng)各種菌落，由此了解土壤中可培養(yǎng)的微生物種群。 土壤微生物的遺傳多樣性土壤微生物的遺傳多樣性是指土壤微生物在基因水平上所攜帶的各類遺傳物質(zhì)和遺傳信息的總和，這是微生物多樣性的本質(zhì)和最終反映。根據(jù)研究手段不同，微生物遺傳多樣性主要表現(xiàn)在基因組大小和基因數(shù)目的多樣性、遺傳物質(zhì)化學(xué)組成和DNA序列的差異、rRNA基因序列的差異以及由基因序列所揭示的遺傳背景多樣性等方面。SSU rDNA包括保守區(qū)和變異區(qū)。目前，人們對(duì)很多種已知微生物的SSU rDNA/ rRNA序列進(jìn)行了測(cè)序(大多數(shù)工作是對(duì)原核生物16S rDNA/ rRNA進(jìn)行的)，并且建立了SSU rDNA/ rRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)[14]。 土壤微生物的結(jié)構(gòu)多樣性土壤微生物的結(jié)構(gòu)多樣性是指土壤微生物群落在細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分上的多樣化程度，這也是導(dǎo)致微生物代謝方式和生理功能多樣化的直接原因。因?yàn)椴煌旱奶卣髯V圖不同，在高度專一性基礎(chǔ)上又具有多樣性，所以標(biāo)記物的組成變化能夠說明微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而對(duì)土壤微生物群落進(jìn)行識(shí)別和定量描述。土壤微生物多樣性受制于土壤性質(zhì)[16]，而微生物多樣性又影響土壤功能多樣性。土壤微生物能夠利用土壤中的有機(jī)碳，其對(duì)有機(jī)碳的利用率是一項(xiàng)反映土壤質(zhì)量的重要特征。Ovreas L用多種方法測(cè)定了土壤微生物后發(fā)現(xiàn)，富含有機(jī)質(zhì)的土壤，其微生物多樣性好于砂土[17]。目前一般采用底物誘導(dǎo)下的代謝響應(yīng)模式測(cè)算土壤微生物群落的代謝功能多樣性[19]。土壤微生物多樣性的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能微生物在生態(tài)系統(tǒng)乃至整個(gè)生物圈的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因而可以說，土壤微生物多樣性的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能是其根本價(jià)值所在?！⊥寥牢⑸飳?duì)有機(jī)物的分解作用微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的最大價(jià)值是分解功能。特別是一些特殊物質(zhì)，如腐殖質(zhì)、蠟和許多合成化學(xué)物質(zhì)，只有微生物才能分解。　土壤微生物在物質(zhì)循環(huán)中的作用地球上大部分元素都以不同的循環(huán)速率參與生物地球化學(xué)循環(huán)。少(微)量元素中的Fe、Mn、Ca和Si則是例外， Fe和Mn以氧化還原的方式快速循環(huán)，但Ca和Si在原生質(zhì)外的其他結(jié)構(gòu)中含量則很高。盡管所有生物都參與生物地球化學(xué)循環(huán)，但微生物在有機(jī)物的礦化中起決定性作用，例如地球上90%以上有機(jī)物的礦化均是由細(xì)菌和真菌完成的[13]。例如，豐富而穩(wěn)定的土壤微生物多樣性有利于保持土壤肥力、防控土傳病害、促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、保障產(chǎn)品質(zhì)量[21]；另從直接生產(chǎn)生物質(zhì)角度來看，某些土壤真菌的大型子實(shí)體也可被食用或藥用。二、土壤微生物多樣性的研究方法土壤微生物多樣性研究方法多種多樣，由傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)發(fā)展到BIOLOG系統(tǒng)分析再發(fā)展到分子水平，土壤微生物多樣性的研究方法向著精確、方便、快速等方向發(fā)展，新的技術(shù)層出不窮。分子生物學(xué)方法又可歸納為三方面：一是基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記法，可對(duì)微生物在特定環(huán)境中的存在與否、分布模式及豐度等情況進(jìn)行研究，具有較高的靈敏性和特異性。三是基于DNA序列測(cè)定的研究方法，分析具體堿基序列的突變情況，與生物信息學(xué)結(jié)合，對(duì)數(shù)據(jù)比較分析，找出微生物多樣性的遺傳進(jìn)化線索。此方法不但簡(jiǎn)單易于掌握，而且在測(cè)定數(shù)量的同時(shí)可以分離出純培養(yǎng)菌株，且可進(jìn)一步做微生物組分分析。從土壤中簡(jiǎn)單提取和平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)不能得到土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生活特征和生態(tài)功能的信息[22]。例如在自然土壤生態(tài)環(huán)境下，許多土壤微生物處于貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，而在實(shí)驗(yàn)室通常用營(yíng)養(yǎng)豐富的牛肉汁蛋白胨來測(cè)定土壤活細(xì)菌的總數(shù)，因而大量的貧營(yíng)養(yǎng)微生物不能生長(zhǎng)，其測(cè)定結(jié)果誤差大；實(shí)驗(yàn)室在分離培養(yǎng)土壤細(xì)菌時(shí)，通常只是在28℃下培養(yǎng)，雖然土壤中存在高溫型細(xì)菌，但土壤中的低溫型細(xì)菌卻被忽視了。所以傳統(tǒng)的研究方法只能作為一種輔助手段，只有與其他先進(jìn)方法結(jié)合起來時(shí)才能較為客觀和全面的反映微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)信息。 BIOLOG鑒定系統(tǒng)BIOLOG系統(tǒng)自從Garland和Miss于1991年建立起來后，廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)土壤微生物群落的功能多樣性:不同土壤類型[23 ]、不同植物物種下的土壤[24 ]、不同管理策略下的農(nóng)業(yè)土壤[25, 26 ]和不同植被的根際土壤[27]。經(jīng)過BIOLOG系統(tǒng)配套軟件分析，并與標(biāo)準(zhǔn)菌種的數(shù)據(jù)庫(kù)比較之后，該菌株的分類地位便被確認(rèn)出來。通過 Biolog 法進(jìn)行環(huán)境微生物研究時(shí)無需分離培養(yǎng)純種微生物，就可獲得有關(guān)微生物群落總體活性與代謝功能的信息，最大限度地保留了微生物群落原來的代謝特征，且靈敏度高，分辨力強(qiáng)，數(shù)據(jù)的讀取與記錄都可由計(jì)算機(jī)輔助完成。另外由于培養(yǎng)環(huán)境的改變可能引起微生物對(duì)碳底物實(shí)際利用能力的改變而造成一定的誤差，并且由于目前所擁有的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)還不完善，所以有些種類還不能被準(zhǔn)確鑒定。 磷脂脂肪酸（PLFA）分析磷酸脂肪酸是微生物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定組成成分，分析脂肪酸的種類及組成比例可鑒別土壤微生物的多樣性。群落的微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，就可通過圖譜的變化得到快速有效的監(jiān)測(cè)。磷脂類化合物只存在于所有活細(xì)胞膜中，一旦生物細(xì)胞死亡， 細(xì)胞膜很快就被降解，磷脂脂肪酸會(huì)被迅速的代謝掉，生物中的磷脂類化合物能顯示出一快速轉(zhuǎn)換率，而且生物可以含有相對(duì)固定量以磷脂類化合物形式作為它們的生物量[30]。磷脂類化合物的這些特征和磷脂類化合物與生物關(guān)系的密切性，決定了可用其作為土壤中微生物標(biāo)志化合物的可能性，此外，脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。PLFA方法雖然能跟蹤研究微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，能快速有效的從環(huán)境樣品種提取大部分脂肪酸，但是也有其局限性。第三，細(xì)菌和真菌在不同的生長(zhǎng)時(shí)期以及環(huán)境壓力下的脂肪酸含量有所變化，給監(jiān)測(cè)帶來困難[32]。如 Jain 等采用特異性的探針對(duì)地下水中的細(xì)窺進(jìn)行了原位雜交，研究了細(xì)菌有關(guān)質(zhì)?；虻拇嬖诤头植记闆r。但FISH的靶序列是留在組織中而沒有必要要像Northern、Southern技術(shù)一樣在雜交之前首先要分離核酸[33]。首先它的16S或者23SrRNA與熒光標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交；再由掃描共焦激光顯微鏡(Scanning confocal laser microscopy，SCLM)觀察固定的細(xì)胞。Gall和Pardue最早描述了熒光原位雜交技術(shù)[34]。后來Manning等人首次將非放射性的原位雜交技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)的研究[35]。而且，F(xiàn)ISH由于事先要根據(jù)已知種屬設(shè)計(jì)探針，不能檢測(cè)出環(huán)境樣品中的未知種屬[36]；但它能將單個(gè)細(xì)菌從復(fù)雜的菌群背景中檢測(cè)出來，并加以定量，所需時(shí)間很短，有望成為一種常規(guī)的簡(jiǎn)便分析方法。1990年，Ward[4]等人利用對(duì)環(huán)境微生物的16SrRNA序列分析，揭示了環(huán)境中存在大量未培養(yǎng)微生物。 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP) / 擴(kuò)增核糖體 DNA 限制性分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis， ARDRA) 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性( RFLP) 又叫擴(kuò)增核糖體 DNA 限制性分析(ARDRA)， 是一種基于 PCR 的分析環(huán)境微生物多樣性的方法。其原理是根據(jù)不同生物個(gè)體或種群之間DNA片段酶切位點(diǎn)有所差異的特點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生長(zhǎng)短、種類、數(shù)目不同的限制性片段，然后對(duì)這些特定DNA片段的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物進(jìn)行分析，根據(jù)特定的限制性酶譜圖可對(duì)群落中的微生物加以區(qū)分。該方法最大的缺點(diǎn)就是酶切后形成的條帶太多，不宜分析，減少限制性內(nèi)切酶的數(shù)量或選用酶切位點(diǎn)為6bp的限制性內(nèi)切酶可減少限制性片斷的數(shù)量，能提高其分辨率。 但是該方法工作量特別大，目前還無人對(duì)這些工作進(jìn)行重復(fù)。若某一引物分子與某一片段DNA模板具有互補(bǔ)的核酸序列，該引物分子就會(huì)結(jié)合到單鏈的DNA模板上，合成一段新的互補(bǔ)DNA鏈。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用EB染色，就可以直接檢驗(yàn)出被擴(kuò)增的DNA多態(tài)性。在同一地點(diǎn)重復(fù)進(jìn)行這種群落篩選的方法，就可以確定在一個(gè)特定位點(diǎn)或一個(gè)特定生態(tài)系統(tǒng)中微生物生物多樣性的變化情況[40]。但是RAPD法實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低，一般可以通過對(duì)單鏈引物進(jìn)行篩選，優(yōu)化PCR條件來克服這一弊端。該技術(shù)利用了RFLP的可靠性和PCR的高效性，對(duì)基因組DNA酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，其實(shí)就是利用2種以上的酶切割DNA形成不同酶切位點(diǎn)的限制酶切片段，在所得的酶切片段上加上雙鏈人工接頭，作為PCR擴(kuò)增的模板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，顯示擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性[41]。不足之處是得到的主要是顯性，而非共顯性標(biāo)記；且AFLP引物需要用同位素標(biāo)記，操作麻煩，目前，用熒光素標(biāo)記，即熒光素標(biāo)記的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，如對(duì)尿路菌、大腸埃希菌、空腸彎曲菌和不動(dòng)桿菌在基因水平作出了鑒定[42]。這樣所得的PCR產(chǎn)物的一端就帶有這種熒光標(biāo)記，再將PCR產(chǎn)物用合適的限制性內(nèi)切酶消化，由于不同菌的核苷酸序列的差異，酶切位點(diǎn)就會(huì)存在差異，酶切后就產(chǎn)生了許多不同長(zhǎng)度的限制性片段。通過只測(cè)定16S rDNA的TRFs，RFLP分布圖的復(fù)雜性減少并且每條可見的帶（片段）代表一個(gè)核型或者操作分類單元。 其次，測(cè)試過程自動(dòng)完成并且結(jié)果以圖譜的形式表示出來[ 43, 4449 ] 。該方法還因快速、靈敏而被廣泛的應(yīng)用于菌種的鑒定、各種微生物群落分析、不同樣品間相互關(guān)系的檢測(cè)、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在時(shí)間和空間尺度上的動(dòng)態(tài)變化研究等[4449] 。 用不同限制性內(nèi)切酶得到的群落指紋信息也會(huì)不同，一般情況下選擇 2個(gè)或 4個(gè)酶進(jìn)行酶切較為合適。 不同構(gòu)象的 DNA 片段進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，每條單鏈處于一定的位置，靶 DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個(gè)堿基被置換時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而揭示該片段中的基因變異。同時(shí)可以切膠純化直接測(cè)序與GenBank上的已知序列比對(duì)，得到特異的基因序列，從而達(dá)到分類的目的。當(dāng)某一種群的 DNA 在群落 DNA 中的含量少于 %時(shí)，SSCP 法便無法檢測(cè)到，若要研究群落中比例極少的群落，需用改進(jìn)的技術(shù)和類群特異的 PCR 引物來完成[50 ]。DGGE或TGGE就是利用堿基序列上存在差異的不同來區(qū)分不同的基因序列。因此，將PCR擴(kuò)增得到的等長(zhǎng)DNA 片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進(jìn)行電泳，序列不同的DNA片段就會(huì)在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度急劇下降， 從而使具有不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置，使用溴化乙錠、SYBR Green I 和銀染色法可以使DGGE中DNA帶的剖面顯現(xiàn)出來[51]，直接反映土壤微生物DNA 的多態(tài)性，通過帶譜的比較就可以說明樣品中的微生物多樣性[ 5253, 54 56 ]。該技術(shù)突出的優(yōu)點(diǎn)是特異片段可從凝膠上切割下來用于像序列分析這樣的進(jìn)一步分析研究。DGGE 技術(shù)在研究微生物多樣性方面優(yōu)于rDNA 基因的克隆和測(cè)序技術(shù)，它可以定量或半定量的方式來顯示微生物種群的組成，避免了帶有相同插入片段的不同克隆的測(cè)序。 核糖體基因間區(qū)分析(ribosomal intergenic spacer analysis, RISA)和自動(dòng)核糖體間隔序列分析(Automated Ribo somal Intergenic Spacer Analysis，ARISA) 核糖體間隔序列分析是以細(xì)菌16S和23SrDNA間隔片段(ITS) 為研究對(duì)象。這些序列普遍是不保守的，即使是在親緣關(guān)系很近的情況下也表現(xiàn)出顯著的序列尤其是長(zhǎng)度特異性。1999，RISA 方法首次被用來顯示土壤菌群結(jié)構(gòu)[57] ，后來在檢測(cè)土壤微生物多樣性、比較污染土壤的微生物多樣性和微生物群落結(jié)構(gòu)的檢測(cè)等方面得到了較廣泛的應(yīng)[ 5861 ]。RISA和ARISA 都是靈敏性高、可以重復(fù)檢測(cè)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的有效方法，但RISA方法耗時(shí)，所需的DNA樣品多，且存在染色方法等缺陷。這種方法不需要預(yù)先培養(yǎng)就能開發(fā)這些微生物的基因組，它能從各種環(huán)境中直接獲得所有微生物總DNA(包括存活的或已死亡的)。宏基因組學(xué)的研究方法是從土壤環(huán)境樣品中直接提取微生物基因組 DNA (宏基因組 )并克隆于不同載體，再將重組載體轉(zhuǎn)移到適宜的宿主以建立宏基因組文庫(kù)，同時(shí)結(jié)合不同的篩選技術(shù)，從基因文庫(kù)中篩選新基因或新的生物活性物質(zhì)。宏基因組測(cè)序技術(shù)，成為對(duì)難培養(yǎng)微生物或不可培養(yǎng)微生物的系統(tǒng)發(fā)育和功能研究的重要方法。我國(guó)土壤及環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)方面宏基因組測(cè)序技術(shù)的研究才剛起步，對(duì)這一新技術(shù)的跟蹤和應(yīng)用，將會(huì)有力地促進(jìn)我國(guó)土壤微生物生態(tài)學(xué)研究的發(fā)展。盡管隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，人類對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)程度已經(jīng)有了很大的進(jìn)步，但是仍然有很多人類無法探測(cè)到的。三、未培養(yǎng)微生物的研究進(jìn)展純培養(yǎng)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室里被頻繁和常規(guī)地用于分離、純化、活細(xì)胞計(jì)數(shù)和培養(yǎng)微生物，一直是微生物學(xué)研究的基石。未培養(yǎng)微生物是指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離、培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物。所以，對(duì)各種自然環(huán)境微生物尤其是對(duì)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行廣泛深入的研究，不僅是微生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究的需要，也是未培養(yǎng)微生物資源開發(fā)利用的基礎(chǔ)。VBNC狀態(tài)微生物具有3種類型：第一種是在現(xiàn)有的培養(yǎng)條件下無法分離培養(yǎng)得到的微生物，它們實(shí)際上是可以生長(zhǎng)繁殖的，因?yàn)椴涣私馄浜线m的生長(zhǎng)繁殖的條件，所以培養(yǎng)不出來，只要深入探索它們的培養(yǎng)條件，這類菌是可以培養(yǎng)的；第二種是由于條件的改變使其轉(zhuǎn)變成無法繁殖的狀態(tài)，但在適當(dāng)?shù)臈l件下可以恢復(fù)其分裂能力；第三種是無論給予任何條件都不能恢復(fù)其生長(zhǎng)繁殖，也就是說只有走向死亡[68]。一些細(xì)菌選擇了快速生長(zhǎng)、仰賴高繁殖率的生長(zhǎng)策略；另外一些則選擇了對(duì)環(huán)境資源高親和性的策略，適應(yīng)低營(yíng)養(yǎng)含量和極低的生長(zhǎng)率。同時(shí)純培養(yǎng)又很難提供對(duì)許多細(xì)菌潛在重要的外源活性物質(zhì)，比如在海水或淡水中ATP的濃度可達(dá)1nmol/L，很可能源自浮游植物和其它浮游生物[70]；許多水生細(xì)菌離不開藻類分泌的生長(zhǎng)因子和維生素[7