【正文】 1]，植物、動(dòng)物病原菌對(duì)寄主活性物質(zhì)的依賴等都是傳統(tǒng)純培養(yǎng)法難以提供的。同一生境的微生物之間聯(lián)系千絲萬(wàn)縷，細(xì)胞與細(xì)胞之間有著廣泛的通訊和聯(lián)系，包括:(1)種間的偏利共生關(guān)(Commersalism)和互惠共生關(guān)系(Mutualism)，兩者的共性是至少一個(gè)群體提供另一些群體所需的生長(zhǎng)因子而使微生物群體獲利；(2)群體感應(yīng)(Quorumensing)，這種關(guān)系被認(rèn)為是通過(guò)細(xì)菌間的信息交流來(lái)調(diào)控細(xì)菌的群體行為[72]:細(xì)胞通過(guò)感應(yīng)一種胞外低分子量的信號(hào)分子來(lái)判斷菌群密度和周圍環(huán)境的變化，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)的細(xì)菌表達(dá)以調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體行為[73]。由于人們目前對(duì)環(huán)境中微生物之間多數(shù)復(fù)雜的相互關(guān)系所知甚少，采用的培養(yǎng)技術(shù)沒(méi)有將這種關(guān)系考慮在內(nèi)：純培養(yǎng)技術(shù)將待培養(yǎng)的微生物與其它微生物群體、以及生存環(huán)境人為地分離開(kāi)，種間的共生關(guān)系和信息交流被阻斷，微生物缺乏必需的生長(zhǎng)因子和信號(hào)分子而死亡，表現(xiàn)出微生物的不可培養(yǎng)性。自然界中的大部分微生物從其原生環(huán)境中被帶走時(shí)就會(huì)萎縮、凋謝，極微小的變化都有可能使其喪失生態(tài)位和生活力，從而難以在人工條件下完全復(fù)蘇或可培養(yǎng)性很低。所以，從生態(tài)角度上看，對(duì)大多數(shù)微生物而言，分離與純化培養(yǎng)是一種生態(tài)災(zāi)難，不能適應(yīng)而難以復(fù)蘇和形成菌落也就在所難免。因此，人們沒(méi)有或無(wú)法完全模擬微生物的自然生存條件，而通常將培養(yǎng)條件進(jìn)行簡(jiǎn)化：將微生物置于恒溫、恒濕、黑暗等環(huán)境中；將微生物限制在“板結(jié)”的瓊脂或不擾動(dòng)的液體介質(zhì)中；簡(jiǎn)化微生物的營(yíng)養(yǎng)組成沒(méi)有提供微生物生長(zhǎng)繁殖所必需的某些化學(xué)物質(zhì)，等等。 忽視生長(zhǎng)緩慢的微生物環(huán)境中很多微生物都聚集生長(zhǎng)，當(dāng)將這些微生物接種至培養(yǎng)基時(shí)，適合生長(zhǎng)的微生物由于生長(zhǎng)快而占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的大量攝取使生長(zhǎng)緩慢的微生物得不到充足營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)受到抑制。例如，生存于貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的微生物盡管能夠在低濃度營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，但是有些微生物生長(zhǎng)速度極為緩慢，在常規(guī)設(shè)定的培養(yǎng)周期內(nèi)(例如1周)沒(méi)有長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的菌落就被遺棄。這兩種情況下，改變微生物生長(zhǎng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)或者檢測(cè)方法，就可以改變微生物的“不可培養(yǎng)性”。克服這些制約因素，就可以較好地提高微生物的可培養(yǎng)性。未培養(yǎng)微生物的研究方法　未培養(yǎng)微生物純培養(yǎng)的研究方法 減少毒性氧物質(zhì)的毒害作用 微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的、微生物自身難以調(diào)節(jié)的過(guò)氧化物、超氧化物和羥基自由基等“毒性氧物質(zhì)”(Reactive oxygen species)[69]，為了減少這些毒性氧，可在培養(yǎng)過(guò)程中加入具有毒性氧降解能力的物質(zhì)，例如過(guò)氧化氫酶、丙酮酸鈉和α酮戊二酸等過(guò)氧化氫降解物和抗氧化劑二硫代二丙酸[75]。其中丙酮酸鈉對(duì)微生物可培養(yǎng)性恢復(fù)的效果最好[79]，且具有穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點(diǎn)。 維持微生物間的相互作用 在培養(yǎng)基中加入微生物相互作用的信號(hào)分子就可簡(jiǎn)單模擬微生物間的相互作用，滿足微生物生長(zhǎng)繁殖的要求，例如加入?；兼滈L(zhǎng)度各異的氮酰高絲氨酸內(nèi)酯均能有效提高細(xì)菌的可培養(yǎng)性[80, 81]，而與革蘭氏陰性菌多種基因調(diào)控有關(guān)的另一種信號(hào)分子cAMP比氮酰高絲氨酸內(nèi)酯能夠促使更多細(xì)菌得到培養(yǎng)[75, 82]。同源性分析結(jié)果表明Rpf存在于多種革蘭氏陽(yáng)性菌中，推測(cè)原核生物可能廣泛存在該類物質(zhì)，因此，可考慮加入不同類型的Rpf來(lái)提高環(huán)境中微生物可培養(yǎng)性[84] 。要將盡可能多的微生物轉(zhuǎn)變成可培養(yǎng)的，就要讓培養(yǎng)條件盡量模擬成原先的自然狀態(tài)。但傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法使?fàn)I養(yǎng)成分和微生物的代謝產(chǎn)物基本上都固定不動(dòng)，這與實(shí)際的自然環(huán)境有很大的差別。Kaeberlein[86]等依據(jù)膜過(guò)濾原理和固定化技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種新型的培養(yǎng)裝置——擴(kuò)散生長(zhǎng)盒(Difusion growth chamber)培養(yǎng)裝置，在自然環(huán)境中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物能通過(guò)膜，而細(xì)菌則在固定化培養(yǎng)過(guò)程中形成菌落。這樣，先前從未培養(yǎng)出的海灘菌株在小室中聚集并出現(xiàn)純培養(yǎng)，高于之前常規(guī)技術(shù)菌落數(shù)的300倍左右，還分離到2種以前未知的微生物。主要特征為將常規(guī)培養(yǎng)器皿進(jìn)行鉆孔改造，內(nèi)襯一層允許活性物質(zhì)流動(dòng)、阻止細(xì)菌自由進(jìn)出的微孔濾膜，然后放入被培養(yǎng)微生物所需的真實(shí)環(huán)境或模擬自然生境的外皿中，讓內(nèi)外環(huán)境中活性物質(zhì)相互滲透保持一致，保證被培養(yǎng)的微生物能夠同原生環(huán)境交流，從而達(dá)到增強(qiáng)部分微生物的可培養(yǎng)性、甚至將部分未培養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)變?yōu)榭膳囵B(yǎng)的目的。這與自然環(huán)境有很多的相似之處，保證微生物原生態(tài)特性在一定程度上延續(xù)，彌補(bǔ)了自然培養(yǎng)和傳統(tǒng)純培養(yǎng)的部分弱點(diǎn)，因而新培養(yǎng)出來(lái)的微生物種類也大大增加了。 稀釋培養(yǎng) 地球上廣泛分布著長(zhǎng)期適應(yīng)貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的細(xì)菌。Franklin[88]采用從原液到104濃度進(jìn)行系列稀釋培養(yǎng)方法來(lái)分析和重建一個(gè)污水微生物群落，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)稀釋梯度都會(huì)新分離到2～3個(gè)獨(dú)特的類群。將樣品稀釋至痕量后，采用小體積48孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離培養(yǎng)微生物。Cho[90]等利用該方法從太平洋近海和遠(yuǎn)洋海水中也分離出多種新菌。如在培養(yǎng)之前對(duì)“絮體”和“顆?！钡冗M(jìn)行適度的超聲處理，使細(xì)胞在分散后進(jìn)行培養(yǎng)，就可能會(huì)使更多的微生物被培養(yǎng)分離[91] 。Janssen .[91]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明培養(yǎng)時(shí)間在12周時(shí)平板上的數(shù)量會(huì)達(dá)到最多，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移所要求的無(wú)菌環(huán)境也應(yīng)該提高，且平板還要防干裂[92]。近年來(lái)，對(duì)于研究環(huán)境微生物的種類和數(shù)量，發(fā)展了生物化學(xué)[93]、生理學(xué)[94]和分子生物學(xué)[95,96]等不需傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，如：核酸指紋圖譜法和宏基因組技術(shù)。宏基因組技術(shù)可以提供比可培養(yǎng)微生物大得多的遺傳信息，Streit等認(rèn)為這對(duì)研究未培養(yǎng)微生物是關(guān)鍵的方法[97]，是一項(xiàng)很有前途的生物學(xué)技術(shù)[65]。因?yàn)椤拔⑸飳W(xué)是關(guān)于有機(jī)體的科學(xué)”。因此，分子生物學(xué)資料應(yīng)只是其它信息(如表型)的補(bǔ)充而不是完全替代?？偨Y(jié)由于微生物群落及其生存環(huán)境的復(fù)雜性，在任何情況下試圖提高微生物的可培養(yǎng)性都不能僅局限于一種或幾種方法，而應(yīng)綜合采用多種有效的方法。和Connon[98]結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，對(duì)高通量培養(yǎng)法進(jìn)行了改進(jìn)，根據(jù)從培養(yǎng)板各孔中針對(duì)性地檢測(cè)SAR11進(jìn)化分支的海洋細(xì)菌的存在，在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行了大量的培養(yǎng)。在一定程度上，微生物能否被培養(yǎng)取決于是否找到了適宜的培養(yǎng)方法，也有報(bào)道認(rèn)為在某些環(huán)境甚至70%左右的細(xì)胞是可以培養(yǎng)的[100]。四、微生物分類鑒定的研究方法微生物分類鑒定方法包括表型鑒定法和分子遺傳學(xué)鑒定法兩大類，分成4個(gè)水平：細(xì)菌形態(tài)和生理生化水平、細(xì)胞組分水平、蛋白質(zhì)分析水平和核酸分析水平。分子遺傳學(xué)鑒定法[101]是核酸水平的鑒定，對(duì)細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析，包括G+Cmol%含量測(cè)定、核酸雜交、PCR技術(shù)、16SrRNA和16～23SrRNA序列分析、全基因組測(cè)序等，此類方法使細(xì)菌種屬定位和親源關(guān)系判別由表型特征深化為基因型鑒定。其分類鑒定的主要依據(jù)是形態(tài)學(xué)特征、生理生化反應(yīng)特征、生態(tài)學(xué)特征以及血清學(xué)反應(yīng)、對(duì)噬菌體的敏感性等。 現(xiàn)代分類鑒定方法 數(shù)值分類法數(shù)值分類法又稱統(tǒng)計(jì)分類法，近20年來(lái)發(fā)展起來(lái)的細(xì)菌分類理論，依據(jù)數(shù)值分析的原理，借助現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)擬分類的微生物對(duì)象按大量表型性狀的相似性程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、歸類的方法。大約是 75%相似度的表觀群可視為同一種，比值達(dá)65%以上者可歸入同一屬。數(shù)值分類法的優(yōu)越性[102]在于它是以分析大量分類特征為基礎(chǔ)，對(duì)于類群的劃分比較客觀和穩(wěn)定；而且促進(jìn)對(duì)細(xì)菌類群的全面考查和觀察，為細(xì)菌的分類鑒定積累大量資料。 化學(xué)分類鑒定法根據(jù)微生物細(xì)胞的特征性化學(xué)組分對(duì)微生物進(jìn)行分類的方法稱化學(xué)分類法（chemotaxonomy）。其中革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的肽聚糖、胞壁單糖、細(xì)胞膜磷酸類脂、異戊二烯醌和全細(xì)胞脂肪酸的分析；革蘭氏陰性細(xì)菌的異戊二烯醌和全細(xì)胞脂肪酸的分析，在細(xì)菌屬和屬以上分類單元系統(tǒng)分析中幾乎已經(jīng)成為不可或缺分類鑒定手段。 遺傳學(xué)分類法DNA是除少數(shù)RNA病毒以外的一切微生物的遺傳信息載體。因此每種微生物DNA的若干代表性數(shù)據(jù)，對(duì)微生物的分類和鑒定工作極為重要。每個(gè)生物種都有特定的GC%范圍，因此可利用（G+C）mol%來(lái)鑒別各種微生物種屬間的親緣關(guān)系及其遠(yuǎn)近程度。一般認(rèn)為任何兩種微生物在（G+C）含量上的差別超過(guò)10%，這兩種微生物就肯定不是同一個(gè)種。要比較兩種細(xì)菌的DNA 堿基對(duì)排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸雜交試驗(yàn)。核酸雜交技術(shù)[105, 106]根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，將2條不同來(lái)源的單鏈核酸進(jìn)行復(fù)性以鑒定菌株間的親源關(guān)系，用于DNADNA(Southern雜交)、DNARNA、RNARNA(Northern雜交)和PNADNA雜交(PNA為肽核酸)。DNADNA雜交適用于種水平的研究，而DNArRNA雜交用于屬和屬以上水平的分類研究。 16SrRNA同源性分析 16SrRNA為細(xì)胞所共有，分子量大小適中，便于序列分析，其功能同源且最為古老，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。16SrRNA[108]序列分析是一種非培養(yǎng)分析技術(shù)，能快速鑒定目前尚不能人工培養(yǎng)的微生物。多相分類多相分類（polyphasic taxonomy）的概念最初由Colwell 于1970年提出，指利用微生物多種不同的信息，包括表型的、基因型的和系統(tǒng)發(fā)育的信息，綜合起來(lái)研究微生物分類和系統(tǒng)進(jìn)化的過(guò)程。參考文獻(xiàn)[1] 周麗霞,丁明懋. 土壤微生物學(xué)特性對(duì)土壤健康的指示作用. 生物多樣性, 2007, 15(2): 162~171[2] Jackinson D S, Ladd J N. 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