【正文】 多相分類幾乎包括了現(xiàn)代分類中所有方面，如傳統(tǒng)分類、化學(xué)分類、分子分類、數(shù)值分類等，被認(rèn)為是目前研究各級(jí)分類單位的最有效手段，可用于所有水平上的分類單位的描述和定義。若兩菌的16SrRNA同源性大于99%，且染色體DNA雜交率大于70%，基因水平上為同一種細(xì)菌。保守性反映生物物種的親源關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育提供線索；高變性則揭示生物物種的特征核酸序列，是種屬鑒定的分子基礎(chǔ)，其序列變化與進(jìn)化距離相對(duì)應(yīng)，在細(xì)菌種屬分類鑒定中廣泛應(yīng)用。一般認(rèn)為核酸雜交同源性小于20%為不同菌屬，20%～60%為屬內(nèi)緊密相關(guān)的種，60%～70%為同種內(nèi)不同亞種，大于70%為同一亞種[107]。其是比上述GC比更細(xì)致和更精確的遺傳性狀指標(biāo)。 核酸分子雜交 不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關(guān)系就越近，反之亦然。值得注意的是，親緣關(guān)系相近的菌，其（G+C）mol%含量相同或者近似，但（G+C）mol%相同或近似的細(xì)菌，其親緣關(guān)系并不一定相近，這是因?yàn)檫@一數(shù)據(jù)還不能反映出堿基對(duì)的排列序列。包括紙層析法、浮力密度法、高效液相色譜法[103]、熱變性溫度(Tm)[104]法和熒光法等。 DNA堿基比例的測(cè)定——（G+C）mol%值 （G+C）mol%值簡(jiǎn)稱“GC比”，表示DNA分子鳥(niǎo)嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的摩爾百分比，它是目前發(fā)表任何微生物新種時(shí)所必須具有的重要指標(biāo)。每一種微生物均有其自己特有的、穩(wěn)定的DNA即基因組的成分和結(jié)構(gòu)，不同種微生物間基因組序列的差異程度代表著它們之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近、疏密。此外某些細(xì)菌原生質(zhì)膜中的異戊間二烯醌、細(xì)胞色素、以及紅外光譜等分析對(duì)于細(xì)菌、放線菌中某些科、屬、種的鑒定也都十分有價(jià)值。細(xì)胞化學(xué)成分鑒定主要包括以下幾個(gè)方面：細(xì)胞壁的化學(xué)組成、全細(xì)胞水解液的糖型、磷酸類脂的成分分析、枝菌酸的分析、醌類的分析、全蛋白組分分析。但在使用數(shù)值分類法對(duì)細(xì)菌菌株分群歸類定種或定屬時(shí)，還應(yīng)做有關(guān)菌株的 pNA堿基的（G+C)mol%和DNA雜交，以進(jìn)一步加以確證。這樣的結(jié)論和傳統(tǒng)分類方法的結(jié)果通常是一致的。數(shù)值分類得到的是表觀群，相關(guān)系數(shù)小者為同屬，相關(guān)系數(shù)大者為同種，實(shí)踐證明，表觀群是等同于分類單元的。一般在科以上分類單位以形態(tài)特征、科以下分類單位以形態(tài)結(jié)合生理生化特征加以區(qū)分。經(jīng)典分類鑒定法經(jīng)典分類法是一百多年來(lái)進(jìn)行微生物分類的傳統(tǒng)方法，是最常用、最重要的分類鑒定指標(biāo)，也是任何現(xiàn)代化分類鑒定方法的基本依據(jù)。表型鑒定法是對(duì)前3個(gè)水平的鑒定，包括常規(guī)鑒定法、數(shù)值分類鑒定法和化學(xué)分類鑒定法。所以，只要微生物學(xué)家和生物技術(shù)學(xué)家勇于迎接挑戰(zhàn)、不斷地深入研究，增強(qiáng)微生物的可培養(yǎng)性、把更多未培養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)變成為可培養(yǎng)仍然是一件大有可為的工作?？膳囵B(yǎng)性本身不是細(xì)菌細(xì)胞的特性[99]。另一方面，還應(yīng)在發(fā)展微生物培養(yǎng)技術(shù)同時(shí)，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，使兩種方法相輔相成，更好地提高微生物的可培養(yǎng)性，如Rapp233。對(duì)于環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的研究必將是以獲得純菌株為最終目的。利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定的類群為數(shù)巨大，對(duì)于這些類群的形態(tài)、生理代謝、遺傳和生態(tài)功能等方面的知識(shí)難以通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究而僅是靠推測(cè)獲得，更談不上獲取有用的代謝產(chǎn)物發(fā)展生物技術(shù)了。雖然非培養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展，但是純培養(yǎng)技術(shù)依然不可替代。他們能夠克服微生物培養(yǎng)技術(shù)的限制，能對(duì)樣品進(jìn)行較客觀的分析，能夠較精確地揭示微生物種類和遺傳的多樣性，能夠獲得可供人類開(kāi)發(fā)利用的豐富多樣的新基因資源。 未培養(yǎng)微生物的非培養(yǎng)研究方法 當(dāng)前，探索未培養(yǎng)微生物的研究方法已作為微生物學(xué)的一個(gè)新挑戰(zhàn)，成為未培養(yǎng)微生物研究的技術(shù)瓶頸，受到極大的關(guān)注。 延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間 對(duì)“寡營(yíng)養(yǎng)菌”的培養(yǎng)，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，使其能長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)的尺度。 分散培養(yǎng) 自然界中很多微生物聚集生長(zhǎng)，形成“絮體”和“顆?！钡?，致使其內(nèi)部的微生物接觸不到培養(yǎng)基而不易被培養(yǎng)。該方法不僅有效提高微生物的可培養(yǎng)性，還可在短期內(nèi)監(jiān)測(cè)大量的培養(yǎng)物，大大提高工作效率。Connon[89]提出高通量培養(yǎng)法(Highthroughput culturing， HTC)。此類細(xì)菌對(duì)過(guò)高的鹽類和有機(jī)物敏感，營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)會(huì)造成它們復(fù)蘇障礙，由于常規(guī)培養(yǎng)方法使用的高濃度營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)不利于微生物生長(zhǎng)，所以適當(dāng)降低營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的濃度可以減弱這種不利影響。當(dāng)然，自然環(huán)境的條件是異常復(fù)雜、動(dòng)態(tài)變化著的，人們不可能將其完全模擬出來(lái)，因而，可以說(shuō)，在可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)人類是不可能將所有的微生物都轉(zhuǎn)變成可培養(yǎng)的。以上三種培養(yǎng)方法的共同點(diǎn)是讓被培養(yǎng)的微生物處于開(kāi)放流動(dòng)的系統(tǒng)中，微生物間的代謝產(chǎn)物及信號(hào)分子可在擴(kuò)散中而被其他菌利用。葉姜瑜等提出了近自然純培養(yǎng)法(Nearnative pure culture technique)[87]。然后將許多這種小室放入沙池，然后用海水覆蓋。ZenglerK等[85]設(shè)計(jì)了一個(gè)非常精妙的方法——細(xì)胞微膠囊法，將細(xì)胞包埋在凝膠微滴板中，在低營(yíng)養(yǎng)的流動(dòng)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，再用流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)微滴板上有多少個(gè)微克隆。如：輔以少量生長(zhǎng)因子的天然海水，或土壤浸提液作為培養(yǎng)基可以很好地培養(yǎng)海洋微生物和土壤微生物。 模擬自然環(huán)境的條件 傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)中微生物具有單一性、分離性和不可交流等特性，而自然生境中微生物具有多樣性、合作性和交流性。Mukamolova等[83]在研究藤黃微球菌時(shí)發(fā)現(xiàn)它分泌一種促進(jìn)復(fù)活因子(Resuscitation promoting factor， Rpf)，可有效促進(jìn)多種處于休眠期的革蘭氏陽(yáng)性菌復(fù)蘇。此外以多聚物為碳源、減少培養(yǎng)環(huán)境中的氧分壓、采用無(wú)害且凝結(jié)作用較好的替代物質(zhì)作為培養(yǎng)基固化劑，均可以減少毒性氧的產(chǎn)生，增加微生物的可培養(yǎng)性。已經(jīng)證實(shí)這些物質(zhì)可使某些處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌的可培養(yǎng)性得到不同程度的恢復(fù)[7578]。目前，提高微生物可培養(yǎng)性的方式可分為兩大類，即改進(jìn)培養(yǎng)措施和開(kāi)發(fā)新型培養(yǎng)技術(shù)?？傊?，導(dǎo)致微生物不可培養(yǎng)的因素有多種，有些是因?yàn)槟壳凹夹g(shù)手段的限制，有些是因?yàn)槿祟愓J(rèn)識(shí)水平的不足。除此之外，還有一些寡營(yíng)養(yǎng)微生物不會(huì)形成菌落，而是在固體培養(yǎng)基表面遷徙生長(zhǎng)(Swarming growth)和擴(kuò)散生長(zhǎng)(Dispersal)，它們形成只能顯微可見(jiàn)的幾個(gè)細(xì)胞組成的小型集合[74]。此外，對(duì)微生物生長(zhǎng)狀況進(jìn)行判斷的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)存在的缺陷，也導(dǎo)致某些微生物生長(zhǎng)不被發(fā)覺(jué)，表現(xiàn)為“不可培養(yǎng)”。所以在自然界中可以生長(zhǎng)繁殖的微生物，在“純培養(yǎng)”中生長(zhǎng)條件得不到滿足，從而導(dǎo)致了微生物的不可培養(yǎng)性。 無(wú)法完全模擬自然界的環(huán)境條件由于目前監(jiān)測(cè)技術(shù)和手段的限制，人們對(duì)微生物生存環(huán)境和自然條件了解尚不充分。此外，高種群多樣性(High species diversity)和低種群多樣性(Low species diversity)微生物的生態(tài)位需求差異很大。 改變微生物的原始生態(tài)位 微生物自然群落存在著演替和波動(dòng)，大多數(shù)微生物的復(fù)蘇不僅需要提供天然樣本中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還需要提供其群落中的小生境，即生態(tài)位。以上這兩種關(guān)系都是微生物生長(zhǎng)所必需的。 破壞微生物之間的共同協(xié)作關(guān)系在自然生態(tài)環(huán)境中，微生物種群常以一些很特殊的方式排列，這樣群落才有活性，而靠單獨(dú)種類的微生物是不能獲得的。土壤中的微生物大多處于“寡營(yíng)養(yǎng)”狀態(tài)，當(dāng)被接種到營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上時(shí)，由于過(guò)量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入，基質(zhì)迅速氧化導(dǎo)致過(guò)多的自由基和超氧化物產(chǎn)生，損害了細(xì)胞甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而在培養(yǎng)基上不產(chǎn)生菌落[69]。實(shí)際上，微生物的不可培養(yǎng)性是由于對(duì)微生物生長(zhǎng)條件及其規(guī)律性的認(rèn)識(shí)嚴(yán)重不足，而采取了偏離微生物生長(zhǎng)實(shí)際情況的培養(yǎng)條件所造成的，這些偏離具體可以包括以下幾個(gè)方面： 改變微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)自然環(huán)境中，現(xiàn)存的任何有機(jī)體都是長(zhǎng)期自然適應(yīng)和進(jìn)化的結(jié)果，微生物也不例外。未培養(yǎng)微生物不可培養(yǎng)的原因1982年徐懷恕[67]，首次發(fā)現(xiàn)并提出了細(xì)菌“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)(Viable but nonculturable state，VBNC)，即細(xì)菌處于不良環(huán)境條件下，通過(guò)一系列類似分化的遺傳程序而使自身處于一種能抵抗饑餓和壓力的狀態(tài)：用常規(guī)方法培養(yǎng)但不能使其生長(zhǎng)繁殖，但仍然具有代謝活性，是活的一種特殊的存在形式。由于這類微生物在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的百分比，無(wú)論是其物種類群，還是新陳代謝途徑、生理生化反應(yīng)與產(chǎn)物等，都存在著不同程度的新穎性和豐富的多樣性，因而其中勢(shì)必蘊(yùn)涵著巨大的可供人類開(kāi)發(fā)利用的生物資源。但是隨著對(duì)微生物研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中僅1%的可培養(yǎng)微生物往往被重復(fù)培養(yǎng)和篩選，而占99%的未培養(yǎng)(NonCulturable)微生物用傳統(tǒng)的方法卻無(wú)法分離[66]。當(dāng)前的各種生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究方法各自都有一些局限因子，因此需要我們不斷完善現(xiàn)有的方法，使之更加簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，同時(shí)需要針對(duì)各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)并將其有機(jī)結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，消除單一方法的誤差，這樣我們就可以更加全面地提供微生物群落組成及其變化方面的信息?？偨Y(jié)對(duì)微生物群落組成進(jìn)行分析是一項(xiàng)重要的工作，因?yàn)槲⑸锝Y(jié)構(gòu)或生理的變化會(huì)引起群落功能的變化。它為全面調(diào)查和挖掘土壤微生物的多樣性及開(kāi)發(fā)利用其資源提供了一種有效的手段[63]，為工業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展提供豐富的資源[64, 65]。Michelle 等人利用BAC 載體構(gòu)建兩個(gè)土壤微生物宏基因組文庫(kù)[62]，共獲得超過(guò)1Gbp 的DNA 分子，通過(guò)對(duì) 16SrRNA 序列的分析發(fā)現(xiàn)，BAC 文庫(kù)中包括，低 G + C %，革蘭氏陽(yáng)性的Acidobacterium，tophagales，Proteobacteria等多種微生物。宏基因組是分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究而形成的由Handelsman等提出的一個(gè)新概念，它包含了比可培養(yǎng)微生物大得多的遺傳信息，其定義為生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，最初用來(lái)定義土壤細(xì)菌混合基因組。 基于DNA序列測(cè)定的研究方法傳統(tǒng)依賴培養(yǎng)的篩選方法丟失了絕大部分微生物資源，由于占群落中絕大部分的微生物不能培養(yǎng)，使得科學(xué)家發(fā)展了一種新方法—宏基因組(Metagenome)。ARISA 和 RISA 的不同之處在于其正向引物被熒光物質(zhì)標(biāo)記，且其測(cè)試過(guò)程自動(dòng)完成。因而通過(guò)通用引物就可以 PCR 擴(kuò)增 ITS，這樣菌群的 RISA 電泳圖譜就可以顯示出該菌群的結(jié)構(gòu)特征，任何 RISA 譜圖的變化，都代表著菌群結(jié)構(gòu)的變化。ITS的大小因不同的物種而變化，即使對(duì)于同一種菌中的不同株，其ITS的長(zhǎng)度和序列也有可能不同。但要注意單一機(jī)體的 rDNA 操縱子之間的序列有明顯的變化，因此單一機(jī)體有在梯度凝膠上產(chǎn)生多重帶型的潛在可能性；此外DGGE 技術(shù)需要的設(shè)備較昂貴。這種策略用于群落DNA 的抽提能在不需培養(yǎng)分離菌的情況下對(duì)存在的優(yōu)勢(shì)16SrDNA 進(jìn)行判斷。TGGE與DGGE不同的是用溫度梯度代替化學(xué)變性劑。在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時(shí)需要不同的變性劑(尿素和甲酰胺的混合物)濃度，DNA 雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會(huì)急劇下降。 變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE) DGGE和TGGE被廣泛應(yīng)用于土壤微生物的多樣性研究、環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測(cè)等方面。SSCP 最大的缺點(diǎn)是有些單鏈 DNA 可能形成不同的構(gòu)象而在不同的電泳位置被檢測(cè)到。 該方法靈敏度較高，能檢測(cè)出核苷酸的差異，能區(qū)別群落中差異較小的種群，也可用于微生物群落演替的分析。 單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(singlestrand conformational polymorphism, SSCP) 該技術(shù)是將不同序列的DNA 片段變性后折疊成不同空間構(gòu)象的單鏈片段，即使是相同長(zhǎng)度的單鏈 DNA，因其順序不同或單個(gè)堿基差異，所形成的構(gòu)象也會(huì)不同。TRFLP法除提取方法和 PCR 反應(yīng)的缺陷以外，引物的選擇和酶切是該方法的關(guān)鍵，因?yàn)椴煌飻U(kuò)增出的片斷不同，獲的TRFLP圖譜也會(huì)產(chǎn)生很大的差異。再者，PCR 的退火溫度及循環(huán)次數(shù)在一定范圍內(nèi)的變化對(duì) TRFLP 圖譜的定量定性分析的影響不大，這在一定程度上確保了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。TRFLP 有很多優(yōu)點(diǎn)，首先它不僅能對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，還可以進(jìn)行定量分析。其中帶有熒光標(biāo)記的TRFs（末端限制性酶切片段）就可以被DNA自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)到，因?yàn)槊糠N菌的末端熒光標(biāo)記片段長(zhǎng)度是唯一的，所以峰值圖上的每一個(gè)峰就至少代表了一種菌，從而反映了微生物群落組成情況。 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)技術(shù)(terminal restriction fragment length poly morphism, TRFLP) TRFLP在技術(shù)上與RFLP相似，只是其中的一個(gè)引物的5’端用熒光物質(zhì)標(biāo)記。AFLP 集 RFLP 和RAPD 的優(yōu)勢(shì)為一體，既具有高的分辨力，準(zhǔn)確性和重復(fù)性，又克服了RFLP的繁瑣操作，成為遺傳多樣性檢測(cè)和系統(tǒng)分類及基因定位的主要分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP對(duì)PCR的引物作了修飾，將引物與酶切片段識(shí)別序列結(jié)合起來(lái)，核心序列與人工接頭互補(bǔ)，從而實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增。 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP) AFLP是PCR和RFLP技術(shù)發(fā)展的一種新型DNA指紋技術(shù)。與RFLP法相比，RAPD法所需的模板量少，操作快，不需要知道DNA序列信息，并且能迅速獲得基因圖譜，標(biāo)記密度較大；而且DNA樣品需要量較少，引物價(jià)格便宜，成本較低。該方法適用于微生物種間、亞種間乃至菌株間的親緣關(guān)系分析，以及未知菌株的快速鑒定等[39]。對(duì)整個(gè)基因組的DNA分子而言，某一引物可能會(huì)與單鏈DNA的許多位點(diǎn)結(jié)合。 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(random ampliflyied pomorphic DNA, RAPD) 隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性方法是以人工隨機(jī)合成的DNA分子為引物，以基因組DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)多態(tài)性DNA片段隨機(jī)合成。另外，同一類群的微生物酶切后會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)片斷而降低檢測(cè)靈敏性。其主要特點(diǎn)是:(1)可以直接研究微生物種群的目標(biāo)