【導(dǎo)讀】發(fā)酵染菌能給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害，防止雜菌污染是任何發(fā)酵工廠的一項重要工作內(nèi)容。尤其是無菌程度要求高的液體深層發(fā)酵，污染防止工作的重要性更為突出。所謂“雜菌”，是指在發(fā)酵培養(yǎng)中侵入了有礙生產(chǎn)的其他微生物。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)。如雜菌量不大，可繼續(xù)發(fā)酵。2，設(shè)備染菌率：統(tǒng)計發(fā)酵罐或其他設(shè)備的染菌率，有利于查找因設(shè)備缺陷而造成的染菌原因。4，不同發(fā)酵階段的染菌率：將整個發(fā)酵周期分成前期、中期和后期三個階段，分別統(tǒng)計其染菌率。“防重于治”，事前防止勝于事后挽救。如果一旦發(fā)生染菌現(xiàn)象就要盡快找出原因及時糾正、堵塞漏洞才能減少損失，并從中吸取經(jīng)驗教訓(xùn)，避免以后有類似情況發(fā)生，保持生產(chǎn)的正常進(jìn)行。但在發(fā)酵生產(chǎn)中，往往因為生產(chǎn)過程的環(huán)節(jié)很多，同時各工廠的生產(chǎn)設(shè)備、產(chǎn)品種類和管理措施不盡相同，引起染菌的原因比較復(fù)雜，有時不能及時找出而耽誤了生

　　

【正文】 2SONa2SONaH2PO4。（2）選擇中性鹽應(yīng)注意的問題使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提純，而本身又易去除。對酶無毒性，應(yīng)用不受影響。價格低廉。廢水處理容易。 6，鹽析劑用量的確定通常采用實驗的方法確定。7，鹽濃度的表示法鹽析法中的鹽濃度通常以鹽溶液的飽和度表示，飽和的溶液成為100%飽和度。8，蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系利用鹽析方法分步分離蛋白質(zhì)各組份和溶液中蛋白質(zhì)實際濃度有很大關(guān)系。 LogC1＝226。KsI1 這里的I1是蛋白質(zhì)開始沉淀時的離子強度。 但如果這種蛋白質(zhì)在溶液中含量較低(設(shè)其濃度為C2)，則需要加人較多的中性鹽，蛋白質(zhì)才開始沉淀。(設(shè)此時離子強度為I2)應(yīng)寫作： LogC2＝βKsI22 Log（C1/C2）＝Ks（I2I1）9，離子強度和類型對鹽析的影響幾種蛋白質(zhì)析出時所需硫酸銨的離子的強度在低離子強度下，許多蛋白質(zhì)比在純水中的溶解度大大增加，但當(dāng)溶液中離子強度不斷增加時，各離子之間及離子與溶質(zhì)分子之間相互競爭水分子，結(jié)果導(dǎo)致溶質(zhì)的溶解度漸漸減少，產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象。一般來說離子強度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。但蛋白質(zhì)的鹽析現(xiàn)象比一般有機分子復(fù)雜一些，蛋白質(zhì)分子大，而且有許多表面電荷，這些表面所帶電荷常隨著周圍離子和溶劑分子排列秩序的影響而不斷變化著，蛋白質(zhì)分子內(nèi)還有許多相互作用的基團(tuán)，這都造成了許多經(jīng)典理論不能十分完美地解釋蛋白質(zhì)鹽析的原因。 幾種蛋白質(zhì)在不同離子強度下的鹽析效應(yīng)見上圖，從圖中可以看出，當(dāng)硫酸按飽和度達(dá)到20%時，纖維蛋白原首先析出，飽和度增至28—33%時，血紅蛋白析出，飽和度再增至33—35%時，擬球蛋白析出，飽和度至50%以上，清蛋白析出，飽和度最后達(dá)到80%時，肌紅蛋白析出?？梢姴煌鞍踪|(zhì)發(fā)生鹽析時所需求的離子強度是不同的。所以用不同離子強度分步鹽析的方法，就可以分離混合物中各種組份。在進(jìn)行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度，順次進(jìn)行。每一組份被鹽析出來后。經(jīng)過固—液分離(冰凍離心或過濾)，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組份鹽析出來。離子強度的大小對蛋白質(zhì)的溶解度起著決定性的影響。但在同樣的離子強度下，離子種類的不同對蛋白質(zhì)溶解度的影響也不同。下圖所示是幾種不同電解質(zhì)下，一氧化碳血紅蛋白溶解度曲線。圖中不同離子種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響，可以從Hofmeister系列理論中獲得解釋： 即離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱。單價鹽如KCl，NaCl的鹽析效果一般比較差。蛋白質(zhì)在不同電解質(zhì)中的鹽析效應(yīng)從圖可知不同鹽類對同一蛋白質(zhì)的鹽所效應(yīng)具有不同的“Ks”值，Ks值可由各種益的鹽析曲線的斜率表示。它們的減少順序是：磷酸鉀＞硫酸鈉＞硫酸銨＞檸檬酸鈉＞硫酸鎂。按照Hofmeister系列，鎂離子比銨離子小，但實際上硫酸銨的鹽析效應(yīng)比硫酸鎂好，主要是鎂離子在同離子強度下產(chǎn)生了一層頗大的離子霧，從而減少了它的鹽析效應(yīng)。10，pH對鹽析的影響一般地說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度越大；如果所帶的電荷減少至接近于零時溶解度最少，我們稱此時的pH值為該蛋白質(zhì)的等電點(PI)。改變pH或特異地加入與蛋白質(zhì)極性基團(tuán)結(jié)合的離子(叫反離子)即可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，也就是改變了蛋白質(zhì)的溶解度。下圖是在不同pH的濃磷酸鹽緩沖液下血紅蛋白的溶解度曲線。從圖中曲線可見，蛋白質(zhì)在不同的pH下有著不同的溶解度，遠(yuǎn)離等電點處蛋白質(zhì)的溶解度最大，等電點處溶解度最小。因此在鹽析時常選擇溶液pH值在該蛋白質(zhì)等電點附近。但必須注意在水中或稀鹽溶液中測得的蛋白質(zhì)等電點與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的。需根據(jù)實際情況調(diào)整pH值至蛋白質(zhì)溶解度最低處，才能使鹽析獲得更好效果。11，溫度對鹽析的影響溫度是影響溶解度的重要因素，對于許多無機鹽和小分子的有機化合物，溫度升高，溶解度也相應(yīng)增大。但對于蛋白質(zhì)、酶等生物大分子在高離子強度溶液中，溫度的升高，它們的溶解度有時不但不升高。反而減少。許多蛋白質(zhì)在高離子強度溶液中25C時的溶解度比4C時溶解度明顯地減少。如圖3—5所示。但必須指出這種溫度升高溶解度的下降現(xiàn)象只有在高離子強度下才能發(fā)生。在低離子強度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度大多數(shù)在一定范圍內(nèi)是隨著溫度增加而增加的。 在一般情況下，蛋白質(zhì)的鹽析溫度要求不嚴(yán)格，可以在室溫下進(jìn)行，只有某些對溫度比較敏感的酶，要求在低溫04C下操作。以避免活力的喪失。二、有機溶劑沉淀1，原理有機溶劑的沉淀作用主要是降低水溶液的介電常數(shù)，溶液的介電常數(shù)減少就意味著溶質(zhì)分子異性電荷庫侖引力的增加從而使溶解度減少。 2，優(yōu)點分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只有在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。沉淀不用脫鹽，過濾比較容易。在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛3，缺點容易引起蛋白質(zhì)變性失活，操作常需在低溫下進(jìn)行。且有機溶劑易燃、易爆、安全要求較高。4，常用的有機溶劑常用的有機溶劑有：乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇。 5，有機溶劑的選擇 有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的能力隨蛋白質(zhì)種類及有機溶劑的種類而異。對曲霉淀粉酶而言，有機溶劑沉淀能力，依次為丙酮＞異丙醇＞乙醇＞甲醇。這個順序還受溫度、pH、鹽離子濃度的影響。丙酮沉淀能力最強，但揮發(fā)損失多，價格相對較高，工業(yè)上一般采用乙醇。 6，有機溶劑沉淀的影響因素影響有機溶劑沉淀的因素有：溫度、蛋白的濃度、pH、金屬離子、離子強度。（1）溫度對有機溶劑沉淀的影響蛋白質(zhì)在有機溶劑中對溫度反應(yīng)特別敏感，溫度稍高即發(fā)生變性。因此，加入的有機溶劑都必須預(yù)冷至較低溫度，操作要在冰浴中進(jìn)行，同時加入有機溶劑必須緩慢而又不斷攪拌以免溶劑局部過濃。溫度的高低會影響到已沉淀的蛋白質(zhì)復(fù)溶。（2）蛋白質(zhì)濃度對有機溶劑沉淀的影響低濃度樣品使用有機溶劑的量大但共沉作用小，利于提高分離的效果；高濃度樣品可以節(jié)省有機溶劑，減少變性危險，但共沉作用大，分離效果較差。（3）pH值對有機溶劑沉淀的影響在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定范圍下選擇溶解度最低處的pH值，有利于提高沉淀效果。適宜的pH值可大大提高分離的分辨能力（4）金屬離子對有機溶劑沉淀的影響一些多價離子如Zn2 +和Ca 2+在一定的pH值下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機溶劑中的溶解度都大大降低，而不影響蛋白質(zhì)的活性。（5）離子強度對有機溶劑沉淀的影響離子強度是影響溶質(zhì)在有機溶劑及水混合液中溶解度的一個重要因素，鹽的濃度大小或太大都對分離有不利影響，對于蛋白質(zhì)，在有機溶劑中鹽的濃度不超過5%比較合適，使用的乙醇量也以不超過二倍體積為宜。7，有機溶劑沉淀應(yīng)注意的問題（1）降低溫度，能增加收率和減少蛋白質(zhì)的變性。（2）所選擇的溶劑必須能和水互溶，而和蛋白質(zhì)不起作用。（3）蛋白質(zhì)的分子量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入的有機溶劑量越少。（4）一種蛋白質(zhì)的溶解度通常會由于另一蛋白質(zhì)的存在而降低。（5）沉淀的蛋白質(zhì)如不能再溶解，就可能已經(jīng)變性。（6）對很多酶，丙酮加量在20%~50%之間，就能產(chǎn)生沉淀。（7）接近等電點時，以引起沉淀所需加入有機溶劑的量較少。（8）當(dāng)溶劑量達(dá)到50%時，則通常只有分子量小于15000的蛋白質(zhì)仍留在溶液中。（9）少量中性鹽的存在能產(chǎn)生鹽溶作用，增加蛋白質(zhì)在有機溶劑水溶液的溶解度。三、等電點沉淀法1，原理等電點沉淀法主要利用兩性分子上的電中性時溶解度最低，而各種兩性分子具有不同等電點而進(jìn)行分離的一種方法。n兩性分子在處于等電點時的pH值，再加上其他沉淀因素，則很易沉淀析出。2，等電點沉淀法的優(yōu)缺點優(yōu)點：很多蛋白質(zhì)的等電點都在偏酸性范圍內(nèi)，而無機酸通常價較廉，井且某些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸的應(yīng)用能為蛋白質(zhì)類食品所允許。同時，常可直接進(jìn)行其他純化操作，無需將殘余的酸除去。缺點：酸化時，易使蛋白質(zhì)失活，這是由于蛋白質(zhì)對低pH比較敏感。第四節(jié) 吸附法在發(fā)酵工業(yè)的下游加工過程中，吸附法應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品的除雜、脫色、有毒物質(zhì)和抗生素的提純精制。應(yīng)用選擇性吸附法分離精制的產(chǎn)品包括：蛋白質(zhì)、核酸、酶、抗生素、氨基酸。一、吸附法的原理吸附法是利用吸附劑與雜質(zhì)、色素物質(zhì)、有毒物質(zhì)、產(chǎn)品之間分子引力的差異，從而起到分離的作用。二、吸附的目的將產(chǎn)品吸附濃縮于吸附劑上；將雜質(zhì)、色素等需要從發(fā)酵液中去除的物質(zhì)吸附于吸附劑上。三、吸附法的優(yōu)缺點1，優(yōu)點可不用或少用有機溶劑；操作簡便、安全、設(shè)備簡單；生產(chǎn)過程中pH變化小，適用于穩(wěn)定性較差的生化物質(zhì)。2，缺點吸附法選擇性差、收率不高。無機吸附劑性能不穩(wěn)定，不能連續(xù)操作，勞動強度大。炭粉等吸附劑影響環(huán)境衛(wèi)生。由于凝膠類吸附劑、大網(wǎng)格聚合物吸附劑的應(yīng)用，克服了以上缺點，近年吸附法又得到重視。四、吸附的類型1，物理吸附吸附劑和吸附物通過分子力(范德華力)產(chǎn)生的吸附。2，化學(xué)吸附化學(xué)吸附是由于吸附劑在吸附物之間的電子轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的，屬于庫侖力 范圍。3，交換吸附吸附劑表面如為極性分子或離子所組成則它會吸引溶液中帶相反電荷的離子而形成雙電層。這種吸附又稱為極性吸附。五、吸附劑的基本要求1，吸附劑要求顆粒密度小，表面積大，但孔隙也不能太多，否則被吸附物質(zhì)不易被洗脫。2，吸附劑的顆粒大小要均勻。3，吸附劑的吸附能力要大，但不能影響洗脫。六、吸附劑的種類1，疏水或非極性吸附劑（活性炭）2，親水或極性吸附劑（硅膠、氧化鋁）3，離子交換樹脂吸附劑七、 影響吸附過程的因素1，吸附劑的性質(zhì) 吸附劑的理化性質(zhì)對吸附的影響很大。吸附劑的性質(zhì)與其原料、合成方法和再生條件有關(guān)。一般要求吸附容量大，吸附速度快和機械強度好。吸附劑的吸附容量除其它外界條件外，主要與比表面積有關(guān)。比表面大，空隙度高，吸附容量就越大。吸附速度主要與顆粒度和孔徑分布有關(guān)，顆粒度越小，吸附速度就越快，但壓頭損失要增大?？讖竭m當(dāng)，有利于吸附物向空隙中擴(kuò)散。吸附劑的機械強度則影響其使用壽命。2，吸附物的性質(zhì)有下列一些規(guī)則可用來預(yù)測吸附的相對量。（1）能使表面張力降低的物質(zhì)，易為表面吸附；（2）溶質(zhì)從較易溶解的溶劑中吸附時，吸附量較少。（3）極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。（4）對于同系列物質(zhì)，吸附量的變化是有規(guī)則的。如按極性減小的次序排列，次序越在后面的物質(zhì)，極性越差，因而越易為非極性吸附劑所吸附而越難為極性吸附劑所吸附。3， 溶液pH值的影響 pH值影響某些化合物的離解度。4，溫度的影響 吸附熱越大，則溫度對吸附的影響越大。5，其它組分的影響 當(dāng)從含有兩種以上組分的溶液中吸附時，根據(jù)溶質(zhì)的性質(zhì)可以互相促進(jìn)，干擾或互不干擾。一般說來，對混合物的吸附較純物質(zhì)的吸附為差。第五節(jié) 離子交換法離子交換作用：是指一個溶液中的某一種離子與一個固體中的另一種具有相同電荷的離子互相調(diào)換位置，即溶液中的離子跑到固體上去，把固體上的離子替換下來。這里溶液稱流動相，而固體稱固定相。在發(fā)酵工業(yè)中可用于分離純化蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、酶、抗生素等物質(zhì)。一、基本原理離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，它的分子中含有可解離的基團(tuán)，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用。交換反應(yīng)都是平衡反應(yīng)，但在層析柱上進(jìn)行時，由于連續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進(jìn)行，所以可以把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來，同時溶液中的離子全部被交換并吸附在樹脂上。如果有兩種以上的成分被交換吸著在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時，其被洗脫的能力則決定于各自洗脫反應(yīng)的平衡常數(shù)。離子交換過程有兩個階段──吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的物質(zhì)可以通過改變pH使吸附的物質(zhì)失去電荷而達(dá)到解離但更多的是通過增加離子強度，使加入的離子與被吸附物質(zhì)競爭離子交換劑上的電荷位置，使被吸附物質(zhì)與離子交換劑解開。不同物質(zhì)與離子交換劑之間形成電鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異 ，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。二、離子交換劑的分類1，陽離子交換劑：磺酸(SO3H)、磷酸(PO3H2)、 羧酸（COOH）和酚羥基（OH）?？煞譃椋簭娝嵝?、中酸型和弱酸型。2，陰離子交換劑：伯胺、(NH2)、仲胺(NHCH3)、叔胺[N（CH3）2]和季胺[N（CH3）2]。可分為：強堿性、中堿性和弱堿性3，兩性離子交換劑4，選擇性離子交換劑5，吸附樹脂6，電子交換樹脂三、影響離子交換速度的因素1，樹脂顆粒的大小；2，樹脂的交聯(lián)度；3，溶液中離子濃度；4，溫度；5，離子的大?。?，離子價；7，樹脂強弱。四、離子交換的操作方式1，分批法2，固定床法3，流動床法第六節(jié) 膜分離過程1748年法國學(xué)者Abbe Nollet首次提出了膜分離現(xiàn)象，經(jīng)過近二個世紀(jì)的摸索、研究，20世紀(jì)50年代膜分離技術(shù)才逐漸發(fā)展成為一門新興高技術(shù)邊緣學(xué)科。1963年第一個膜滲析器的誕生開創(chuàng)了膜分離技術(shù)的新紀(jì)元，二、三十年來得到了迅猛的發(fā)展，在各個工業(yè)領(lǐng)域及科研中得到大規(guī)模應(yīng)用，出現(xiàn)了各種有價值的微濾、超濾、納濾和反滲透等分離膜 。 膜分離技術(shù)的優(yōu)點1，適用范圍廣； 2，膜分離過程為物理過程，不需加入化學(xué)藥劑； 3，膜分離技術(shù)分離裝置簡單，占地面積小，系統(tǒng)集成容易 ；4，膜分離過程系統(tǒng)簡單、操作容易，且易控制，便于維修，有利于生產(chǎn)自動化的推廣與普及。一、膜分離方法的分類