【導(dǎo)讀】感中心和省級(jí)流感實(shí)驗(yàn)室兩級(jí)組成。血凝抑制實(shí)驗(yàn)可以在安全Ⅱ級(jí)+實(shí)驗(yàn)室里操作。實(shí)驗(yàn)室要求請(qǐng)參照國(guó)家有關(guān)核酸檢測(cè)要求的規(guī)定。須在生物安全Ⅲ級(jí)實(shí)驗(yàn)室；流感中心做病毒的分離工作。對(duì)各省報(bào)告的禽流感疑似病例或確診病例進(jìn)行復(fù)核、確認(rèn)；防護(hù)原則》做好個(gè)人防護(hù)。血清以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。1）咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病的頭3天采集；式二份，其中一份單獨(dú)保存，以備復(fù)核。采集的標(biāo)本若不能在24小。時(shí)內(nèi)送達(dá)，則應(yīng)盡快在－70℃以下保存。20℃冰箱短時(shí)間暫存，并盡快聯(lián)系遞送標(biāo)本。編號(hào)、姓名，同時(shí)也將標(biāo)本有關(guān)信息填在禽流感人體標(biāo)本送檢登記表，患者2份以上的密封標(biāo)本，可以放在同一個(gè)塑料袋內(nèi)再次做密封。所有容器必須印有生物危險(xiǎn)標(biāo)識(shí)。陽(yáng)性或H5的RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性。4．病人恢復(fù)期血清比急性期血清的H5抗體有4倍或以上增高。行的甲、乙型毒株的可能。

　　

【正文】 沉淀線，沉淀線清晰度取決于抗原和抗體的濃度。 沉淀線最好在黑背景下進(jìn)行觀察，而光線是在黑背景后面射出。特異 的陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性血清與抗原及測(cè)定血清與抗原間呈連續(xù)的沉淀線。如出現(xiàn)交叉沉淀線，表明測(cè)定血清缺乏與陽(yáng)性血清一致的抗體。如陽(yáng)性血清與陽(yáng)性抗原不出現(xiàn)沉淀線或陰性對(duì)照抗血清與陽(yáng)性抗原出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照的孔一樣的沉淀線，表明實(shí)驗(yàn)需重做。 附錄 F （資料附錄） 流感快速診斷方法 用酶免疫測(cè)定來(lái)直接查甲型和乙型流感病毒。 下列兩種方法一般在 1520 分鐘內(nèi)就可觀察結(jié)果。 F1 Directigen Flu A Kit 快速診斷甲型流感病毒。 中國(guó)最大的管理資源中心 26 測(cè)定的第一步采集的標(biāo)本用含溶解細(xì)胞的去污劑和粘液溶解劑的 提取溶液處理。稀釋標(biāo)本使之成均質(zhì)，然后，加到濾膜上。病毒抗原結(jié)合到膜上。下一步，洗掉非結(jié)合物，同時(shí)加入兔 IgG 來(lái)阻斷膜被后來(lái)加入試劑非特異性結(jié)合。加入酶標(biāo)記的抗流感病毒特異的單抗，反復(fù)洗滌后，與兩種底物溶液孵育，通過(guò)測(cè)定結(jié)合酶活性來(lái)作判斷。病毒抗原存在時(shí)，在膜上就可見到一個(gè)紫色三角形。病毒抗原在膜中央一個(gè)小圓區(qū)域內(nèi)作為試驗(yàn)對(duì)照。在試劑盒中含有陽(yáng)性和陰性對(duì)照材料。 F1． 1 實(shí)驗(yàn)材料 F1． 1． 1 Directigen Flu A Kit Becton Dickinson， Cat 856020 F1． 1． 2 測(cè)定標(biāo)本 F1． 1． 3 甲型流感病毒參照抗原 F1． 2 實(shí)驗(yàn)流程 將加樣控制器嵌入檢測(cè)板 分別將 125ul 待檢樣品或 DMEMS 細(xì)胞培養(yǎng)液加入兩個(gè)加液管 每個(gè)加液管內(nèi)加 8 滴（約 ）試劑 A 以提取抗原 于加液管上加滴頭后充分混合樣品 將加液管內(nèi)所有的混合物逐滴加 入檢測(cè)板中央的檢測(cè)孔 （每個(gè)加液器內(nèi)的樣品加一個(gè)檢測(cè)板，注意避免氣泡） 快速滴加試劑 1， 直至加滴檢測(cè)孔（沖洗） 待所以液體被吸附后去掉檢測(cè)板上的加樣 控制器 加 4 滴試劑 2（封閉吸附膜以防抗體的非特異性吸附） 待所有液體被吸附后 加 4 滴試劑 3（酶聯(lián)抗體） 待所有液體被吸附后置室溫 2min 快速滴加試劑 4， 直至加滴檢測(cè)孔（沖洗） 中國(guó)最大的管理資源中心 27 待所有液體被吸附后 加 4 滴試劑 5（沖洗） 待所有液體被吸附后 加 4 滴試劑 6（底物 1） 孔內(nèi)出現(xiàn)淡黃色 加 4 滴試劑 7（底物 2） 置室溫 530 min 加 4 滴試劑 8 終止反應(yīng)（檸檬酸） F1． 3 結(jié)果分析 陽(yáng)性： 檢測(cè)板中央可見一紫紅色三角型。 陰性：檢測(cè)板中央可見一紫紅色圓點(diǎn)。 不詳：檢測(cè)板中央既無(wú)紫紅三角型又無(wú)紫紅色圓點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)需重復(fù)。 F1． 4 對(duì)照 濾器中央病毒抗原斑點(diǎn)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。如果實(shí)驗(yàn)完畢不出現(xiàn)任何斑點(diǎn)，表明不是濾器軟片就是有的試劑過(guò)期了。在試劑盒中含有陽(yáng)性和陰性對(duì)照材料。病毒陽(yáng)性和陰性 標(biāo)本可存在 20℃條件下，用做以后測(cè)定的對(duì)照。 F1． 5 局限性 標(biāo)本質(zhì)量嚴(yán)重影響著測(cè)試的敏感性。當(dāng)用實(shí)驗(yàn)室生長(zhǎng)的病毒，其測(cè)定的水平在無(wú)細(xì)胞條件下為 1000 至 2020 蝕斑形成單位（ PFU）或大約 20個(gè)受感的細(xì)胞。因此，采樣時(shí)必須收集足夠量的上皮細(xì)胞，陰性結(jié)果不能完全排除患者得過(guò)甲型流感病毒感染的可能性。因此，陰性只可認(rèn)為測(cè)不出甲型流感病毒。 如果粘液沒有效溶解或從標(biāo)本中去除掉，它能阻礙病毒抗原附著在膜上。這樣就會(huì)造成假陰性結(jié)果。這些標(biāo)本只能通過(guò)非常慢地吸附到膜來(lái)加以鑒定或把它們進(jìn)一步 1： 4 稀釋后進(jìn)行重測(cè)定 。 在試劑盒中所含的試劑和濾器裝置均有不同的有效期，用時(shí)需檢查一下它們是否已過(guò)期。 F2 FLU OIA KIT 快速診斷甲、乙型流感病毒 FLU OIA 測(cè)定包含甲、乙型流感病毒 NP 蛋白提取和測(cè)定。這個(gè)光學(xué)免疫測(cè)定技術(shù)是通過(guò)分子薄膜光學(xué)厚度的物理改變用肉眼直接觀察。這種改變是由于抗原和抗體結(jié)合到硅晶片的光學(xué)表面所造成。當(dāng)提取的抗原直接放入光學(xué)表面，固定在光學(xué)表面上的特異抗體就會(huì)捕捉抗原。洗滌后，加入底物就會(huì)增加分子薄膜的厚度。這種厚度的改變就導(dǎo)致了反射光線方向的改變。同時(shí)肉眼所見到的為一種顏色的改變 。光學(xué)厚度改變?cè)斐梢环N特殊的可見的顏色改變。在金黃色背景下出現(xiàn)紫光斑點(diǎn)為陽(yáng)性結(jié)果。如果標(biāo)本中不含有抗原，就不會(huì)被固定抗體所捕捉。因此，光學(xué)厚度維持不變，表面維持原來(lái)的金黃色，表明是陰性結(jié)果。 中國(guó)最大的管理資源中心 28 F2． 1 實(shí)驗(yàn)材料 F2． 1． 1 FLU OIA Kit。 Biostar， Cat FLU 30 F2． 1． 2 待檢樣品 F2． 1． 3 甲、乙型流感病毒參照毒株 F2． 2 實(shí)驗(yàn)流程 從冰箱中取出試劑應(yīng)置室溫使之溫度變至 18℃ 30℃。試劑盒打開后， 洗液置室溫保存，如果儲(chǔ)存冰箱，用時(shí)洗液至少置室 溫 2h。 ↓ 在提取管中加入 3 滴標(biāo)本稀釋液和 2 滴試劑 2。 ↓ 患者標(biāo)本的拭子馬上加入提取管。讓拭子與溶液充分相混， 以便讓液體移至纖維管的頂部。至少停留 3 min 但不超出 5 min。 ↓ 當(dāng)再加入一滴試劑 2 時(shí)，扶著拭子柄讓其在提取管的倒面。 然后，用拭子讓其與試劑充分相混。讓拭子在管壁不斷地?cái)D壓， 盡量擰干，讓 液體越多越好，最后拭子棄之。 ↓ 用干凈的吸管吸一滴提取的標(biāo)本直接置測(cè)試表面中心。 至少停留 6 min，但不超出 7 min。 ↓ 用洗液充分洗滌測(cè)試表面，但千萬(wàn)要小心， 不能將吸附在測(cè)試表面的材料都洗掉。 ↓ 檢查并核實(shí)在測(cè)定裝置蓋子上的吸水紙是否是在第一部位置上。 關(guān)緊測(cè)試裝置，停留 10sec 來(lái)去除測(cè)試表面殘余的濕氣。 ↓ 打開蓋，把吸水紙置第二部位置上，在測(cè)試表面中央加入一滴底物。 至少停留 6 min，但不超出 7 min。 ↓ 10 sec，打開并檢查顏色的改變。 F2． 3 結(jié)果判斷 F2． 3． 1 純蘭色 /沿著中央對(duì)照點(diǎn)出現(xiàn)強(qiáng)的紫色反應(yīng)圈為陽(yáng)性結(jié)果。 F2． 3． 2 不出現(xiàn)任何反應(yīng)圈，只見中央對(duì)照點(diǎn)者為陰性結(jié)果。 F2． 3． 3 如果中央對(duì)照不出現(xiàn)，全部實(shí)驗(yàn)作廢，需重復(fù)測(cè)定。 F2． 4 對(duì)照 每 次測(cè)定必須設(shè)抗原對(duì)照，測(cè)定時(shí)在測(cè)定表面中央出現(xiàn)一個(gè)小蘭點(diǎn) /紫色斑點(diǎn)。滅活的乙型流感病毒抗原對(duì)照用來(lái)調(diào)試試劑。無(wú)抗原對(duì)照的試驗(yàn)結(jié)果是不可靠的。 另外陽(yáng)性和陰性對(duì)照也是必須的。陽(yáng)性對(duì)照抗原為滅活的甲型流感病毒。陰性對(duì)照抗原為一種蛋白溶液。 F2． 5 局限性 結(jié)果好壞取決于標(biāo)本采集的質(zhì)量，已滅活的病毒也可進(jìn)行測(cè)定；陰性結(jié)果不能完全排除其它非流感病毒感染；陰性結(jié)果也不能完全排除患者曾得過(guò)流感感 中國(guó)最大的管理資源中心 29 染，因此，只能解釋為查不到甲型或乙型流感病毒；糞便標(biāo)本不能進(jìn)行測(cè)定。 F3 直接檢查呼吸道脫落上皮細(xì)胞內(nèi)病毒特異抗原 F3． 1 原理 流感病毒主要感染部位是在呼吸道上皮細(xì)胞，因此在病人呼吸道標(biāo)本的脫落細(xì)胞中含有流感病毒抗原和核酸，通過(guò)直接檢查上皮細(xì)胞內(nèi)病毒特異抗原或核酸即可診斷。檢查方法可采用免疫熒光法查病毒抗原，一般于 34h 內(nèi)即可完成，采用 RTPCR 法查病毒核酸 24 h 內(nèi)也可完成。 F3． 2 標(biāo)本的采集和制片 標(biāo)本采集最好用負(fù)壓抽取法收集呼吸道分泌物，尤其脫落的細(xì)胞?？蓪⒚繕?biāo)本分成兩份，一份低溫凍存?zhèn)渥鞑《痉蛛x等。另一份用 的 PBS 將粘液吹打散， 1500rpm離心 15min，棄上清，細(xì)胞沉淀用 PBS 洗 12 次， 末次離心后棄上清，加入適量 PBS 使細(xì)胞垂懸，滴加于帶圈的玻璃片上，室溫干燥，而后冷丙酮固定 10 min。 F3． 3 間接免疫熒光法 F3． 3． 1 用 10%新鮮羊或牛血清封閉標(biāo)本片，置濕盒中于 37℃ 30 min。 F3． 3． 2 分別加入適當(dāng)稀釋度的抗甲型和乙型流感病毒型特異的單克隆抗體，置濕盒中于 37℃ 1h 。在 PBS 中洗兩次，共 10 min。 F3． 3． 3 加適當(dāng)稀釋度的兔抗鼠熒光素結(jié)合物，置 37℃ 1h。在 PBS 中洗三次，共 10 min，末次用蒸餾水洗一下。 F3． 3． 4 于熒光顯微鏡下觀 察結(jié)果。觀察到三個(gè)以上胞漿內(nèi)或胞核內(nèi)熒光陽(yáng)性即可判為陽(yáng)性。 注： 也可將采集的標(biāo)本進(jìn)行核酸提取，然后經(jīng) RTPCR 進(jìn)行擴(kuò)增，能特異擴(kuò)增出為陽(yáng)性，不能特異擴(kuò)增出為陰性。 F4 標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞增殖后查病毒抗原 F4． 1 原理 采集標(biāo)本接種敏感細(xì)胞過(guò)夜增殖后，將細(xì)胞消化分散制成抗原片，再用免疫熒光法或免疫酶染法檢查細(xì)胞內(nèi)病毒抗原，也可用 RTPCR 對(duì)病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)定。 標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞增殖后查病毒抗原或核酸，雖需第二天方可得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但可大大提高檢測(cè)的敏感性。 F4． 2 標(biāo)本采集同 A2。 F4． 3 標(biāo)本接種培養(yǎng)及制片。 標(biāo)本接種見 A5． 1，置 35℃過(guò)夜培育后，倒掉維持液，用消化液（ 1 份 %胰酶 +4 份 Versene）將細(xì)胞消化下來(lái)。用 PBS 洗一次，然后滴加于帶圈的玻璃片上，室溫干燥，冷丙酮固定。同法制備未經(jīng)感染的正常 MDCK 細(xì)胞片即為正常對(duì)照細(xì)胞。 F4． 4 間接免疫熒光法 見 F3． 3。 F4． 5 間接免疫酶染法 F4． 5． 1 加單克隆抗體同 F3． 3． 2。 中國(guó)最大的管理資源中心 30 F4． 6 間接免疫酶染法 F4． 6． 1 加單克隆抗體同 F3． 3． 2。 F4． 6． 2 加適當(dāng)稀釋度的羊抗鼠酶標(biāo)結(jié)合物，濕盒中置 37℃ 1h，用 PBS 洗兩次10 min。 F4． 6． 3 加鄰苯二胺底物溶液，其配制法為： 4mg 鄰苯二胺 +10ml 磷酸 —檸檬酸緩沖液 +15ul H2O2。 磷酸緩沖液配制法為：先分別配制 氫二鈉，然而，分別按 和 相混，再加入等容量（ 50ml）去離子水，混勻即為 磷酸 — 檸檬酸緩沖液。 加入底物液 35min 即可觀察結(jié)果。 F4． 6． 4 結(jié)果觀察 于倒置顯微鏡下觀察（觀察時(shí)細(xì)胞要濕，如果細(xì)胞已干，可以加入一滴自來(lái)水 ）。觀察到棕紅色深染細(xì)胞，根據(jù)觀察到此細(xì)胞多少，記錄為 ++++， +++， ++，+， 177。 ， — 。以觀察到一個(gè)加號(hào)以上深染細(xì)胞判為陽(yáng)性；有時(shí)可觀察到單個(gè)深染細(xì)胞被無(wú)色或淡紅色細(xì)胞所包圍，而正常細(xì)胞呈無(wú)色或淡紅色，亦可判為陽(yáng)性。 F5 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ RTPCR）對(duì)流感診斷和流感病毒株鑒定 RTPCR 為一種很有用的技術(shù)，它能測(cè)出非常低水平的流感病