【導讀】感中心和省級流感實驗室兩級組成。血凝抑制實驗可以在安全Ⅱ級+實驗室里操作。實驗室要求請參照國家有關核酸檢測要求的規(guī)定。須在生物安全Ⅲ級實驗室；流感中心做病毒的分離工作。對各省報告的禽流感疑似病例或確診病例進行復核、確認；防護原則》做好個人防護。血清以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。1）咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病的頭3天采集；式二份，其中一份單獨保存，以備復核。采集的標本若不能在24小。時內送達，則應盡快在－70℃以下保存。20℃冰箱短時間暫存，并盡快聯(lián)系遞送標本。編號、姓名，同時也將標本有關信息填在禽流感人體標本送檢登記表，患者2份以上的密封標本，可以放在同一個塑料袋內再次做密封。所有容器必須印有生物危險標識。陽性或H5的RT-PCR檢測陽性。4．病人恢復期血清比急性期血清的H5抗體有4倍或以上增高。行的甲、乙型毒株的可能。

　　

【正文】 沉淀線，沉淀線清晰度取決于抗原和抗體的濃度。 沉淀線最好在黑背景下進行觀察，而光線是在黑背景后面射出。特異 的陽性結果，陽性血清與抗原及測定血清與抗原間呈連續(xù)的沉淀線。如出現(xiàn)交叉沉淀線，表明測定血清缺乏與陽性血清一致的抗體。如陽性血清與陽性抗原不出現(xiàn)沉淀線或陰性對照抗血清與陽性抗原出現(xiàn)與陽性對照的孔一樣的沉淀線，表明實驗需重做。 附錄 F （資料附錄） 流感快速診斷方法 用酶免疫測定來直接查甲型和乙型流感病毒。 下列兩種方法一般在 1520 分鐘內就可觀察結果。 F1 Directigen Flu A Kit 快速診斷甲型流感病毒。 中國最大的管理資源中心 26 測定的第一步采集的標本用含溶解細胞的去污劑和粘液溶解劑的 提取溶液處理。稀釋標本使之成均質，然后，加到濾膜上。病毒抗原結合到膜上。下一步，洗掉非結合物，同時加入兔 IgG 來阻斷膜被后來加入試劑非特異性結合。加入酶標記的抗流感病毒特異的單抗，反復洗滌后，與兩種底物溶液孵育，通過測定結合酶活性來作判斷。病毒抗原存在時，在膜上就可見到一個紫色三角形。病毒抗原在膜中央一個小圓區(qū)域內作為試驗對照。在試劑盒中含有陽性和陰性對照材料。 F1． 1 實驗材料 F1． 1． 1 Directigen Flu A Kit Becton Dickinson， Cat 856020 F1． 1． 2 測定標本 F1． 1． 3 甲型流感病毒參照抗原 F1． 2 實驗流程 將加樣控制器嵌入檢測板 分別將 125ul 待檢樣品或 DMEMS 細胞培養(yǎng)液加入兩個加液管 每個加液管內加 8 滴（約 ）試劑 A 以提取抗原 于加液管上加滴頭后充分混合樣品 將加液管內所有的混合物逐滴加 入檢測板中央的檢測孔 （每個加液器內的樣品加一個檢測板，注意避免氣泡） 快速滴加試劑 1， 直至加滴檢測孔（沖洗） 待所以液體被吸附后去掉檢測板上的加樣 控制器 加 4 滴試劑 2（封閉吸附膜以防抗體的非特異性吸附） 待所有液體被吸附后 加 4 滴試劑 3（酶聯(lián)抗體） 待所有液體被吸附后置室溫 2min 快速滴加試劑 4， 直至加滴檢測孔（沖洗） 中國最大的管理資源中心 27 待所有液體被吸附后 加 4 滴試劑 5（沖洗） 待所有液體被吸附后 加 4 滴試劑 6（底物 1） 孔內出現(xiàn)淡黃色 加 4 滴試劑 7（底物 2） 置室溫 530 min 加 4 滴試劑 8 終止反應（檸檬酸） F1． 3 結果分析 陽性： 檢測板中央可見一紫紅色三角型。 陰性：檢測板中央可見一紫紅色圓點。 不詳：檢測板中央既無紫紅三角型又無紫紅色圓點，實驗需重復。 F1． 4 對照 濾器中央病毒抗原斑點作為實驗對照。如果實驗完畢不出現(xiàn)任何斑點，表明不是濾器軟片就是有的試劑過期了。在試劑盒中含有陽性和陰性對照材料。病毒陽性和陰性 標本可存在 20℃條件下，用做以后測定的對照。 F1． 5 局限性 標本質量嚴重影響著測試的敏感性。當用實驗室生長的病毒，其測定的水平在無細胞條件下為 1000 至 2020 蝕斑形成單位（ PFU）或大約 20個受感的細胞。因此，采樣時必須收集足夠量的上皮細胞，陰性結果不能完全排除患者得過甲型流感病毒感染的可能性。因此，陰性只可認為測不出甲型流感病毒。 如果粘液沒有效溶解或從標本中去除掉，它能阻礙病毒抗原附著在膜上。這樣就會造成假陰性結果。這些標本只能通過非常慢地吸附到膜來加以鑒定或把它們進一步 1： 4 稀釋后進行重測定 。 在試劑盒中所含的試劑和濾器裝置均有不同的有效期，用時需檢查一下它們是否已過期。 F2 FLU OIA KIT 快速診斷甲、乙型流感病毒 FLU OIA 測定包含甲、乙型流感病毒 NP 蛋白提取和測定。這個光學免疫測定技術是通過分子薄膜光學厚度的物理改變用肉眼直接觀察。這種改變是由于抗原和抗體結合到硅晶片的光學表面所造成。當提取的抗原直接放入光學表面，固定在光學表面上的特異抗體就會捕捉抗原。洗滌后，加入底物就會增加分子薄膜的厚度。這種厚度的改變就導致了反射光線方向的改變。同時肉眼所見到的為一種顏色的改變 。光學厚度改變造成一種特殊的可見的顏色改變。在金黃色背景下出現(xiàn)紫光斑點為陽性結果。如果標本中不含有抗原，就不會被固定抗體所捕捉。因此，光學厚度維持不變，表面維持原來的金黃色，表明是陰性結果。 中國最大的管理資源中心 28 F2． 1 實驗材料 F2． 1． 1 FLU OIA Kit。 Biostar， Cat FLU 30 F2． 1． 2 待檢樣品 F2． 1． 3 甲、乙型流感病毒參照毒株 F2． 2 實驗流程 從冰箱中取出試劑應置室溫使之溫度變至 18℃ 30℃。試劑盒打開后， 洗液置室溫保存，如果儲存冰箱，用時洗液至少置室 溫 2h。 ↓ 在提取管中加入 3 滴標本稀釋液和 2 滴試劑 2。 ↓ 患者標本的拭子馬上加入提取管。讓拭子與溶液充分相混， 以便讓液體移至纖維管的頂部。至少停留 3 min 但不超出 5 min。 ↓ 當再加入一滴試劑 2 時，扶著拭子柄讓其在提取管的倒面。 然后，用拭子讓其與試劑充分相混。讓拭子在管壁不斷地擠壓， 盡量擰干，讓 液體越多越好，最后拭子棄之。 ↓ 用干凈的吸管吸一滴提取的標本直接置測試表面中心。 至少停留 6 min，但不超出 7 min。 ↓ 用洗液充分洗滌測試表面，但千萬要小心， 不能將吸附在測試表面的材料都洗掉。 ↓ 檢查并核實在測定裝置蓋子上的吸水紙是否是在第一部位置上。 關緊測試裝置，停留 10sec 來去除測試表面殘余的濕氣。 ↓ 打開蓋，把吸水紙置第二部位置上，在測試表面中央加入一滴底物。 至少停留 6 min，但不超出 7 min。 ↓ 10 sec，打開并檢查顏色的改變。 F2． 3 結果判斷 F2． 3． 1 純蘭色 /沿著中央對照點出現(xiàn)強的紫色反應圈為陽性結果。 F2． 3． 2 不出現(xiàn)任何反應圈，只見中央對照點者為陰性結果。 F2． 3． 3 如果中央對照不出現(xiàn)，全部實驗作廢，需重復測定。 F2． 4 對照 每 次測定必須設抗原對照，測定時在測定表面中央出現(xiàn)一個小蘭點 /紫色斑點。滅活的乙型流感病毒抗原對照用來調試試劑。無抗原對照的試驗結果是不可靠的。 另外陽性和陰性對照也是必須的。陽性對照抗原為滅活的甲型流感病毒。陰性對照抗原為一種蛋白溶液。 F2． 5 局限性 結果好壞取決于標本采集的質量，已滅活的病毒也可進行測定；陰性結果不能完全排除其它非流感病毒感染；陰性結果也不能完全排除患者曾得過流感感 中國最大的管理資源中心 29 染，因此，只能解釋為查不到甲型或乙型流感病毒；糞便標本不能進行測定。 F3 直接檢查呼吸道脫落上皮細胞內病毒特異抗原 F3． 1 原理 流感病毒主要感染部位是在呼吸道上皮細胞，因此在病人呼吸道標本的脫落細胞中含有流感病毒抗原和核酸，通過直接檢查上皮細胞內病毒特異抗原或核酸即可診斷。檢查方法可采用免疫熒光法查病毒抗原，一般于 34h 內即可完成，采用 RTPCR 法查病毒核酸 24 h 內也可完成。 F3． 2 標本的采集和制片 標本采集最好用負壓抽取法收集呼吸道分泌物，尤其脫落的細胞?？蓪⒚繕吮痉殖蓛煞?，一份低溫凍存?zhèn)渥鞑《痉蛛x等。另一份用 的 PBS 將粘液吹打散， 1500rpm離心 15min，棄上清，細胞沉淀用 PBS 洗 12 次， 末次離心后棄上清，加入適量 PBS 使細胞垂懸，滴加于帶圈的玻璃片上，室溫干燥，而后冷丙酮固定 10 min。 F3． 3 間接免疫熒光法 F3． 3． 1 用 10%新鮮羊或牛血清封閉標本片，置濕盒中于 37℃ 30 min。 F3． 3． 2 分別加入適當稀釋度的抗甲型和乙型流感病毒型特異的單克隆抗體，置濕盒中于 37℃ 1h 。在 PBS 中洗兩次，共 10 min。 F3． 3． 3 加適當稀釋度的兔抗鼠熒光素結合物，置 37℃ 1h。在 PBS 中洗三次，共 10 min，末次用蒸餾水洗一下。 F3． 3． 4 于熒光顯微鏡下觀 察結果。觀察到三個以上胞漿內或胞核內熒光陽性即可判為陽性。 注： 也可將采集的標本進行核酸提取，然后經 RTPCR 進行擴增，能特異擴增出為陽性，不能特異擴增出為陰性。 F4 標本經敏感細胞增殖后查病毒抗原 F4． 1 原理 采集標本接種敏感細胞過夜增殖后，將細胞消化分散制成抗原片，再用免疫熒光法或免疫酶染法檢查細胞內病毒抗原，也可用 RTPCR 對病毒核酸進行擴增和測定。 標本經敏感細胞增殖后查病毒抗原或核酸，雖需第二天方可得出實驗結果，但可大大提高檢測的敏感性。 F4． 2 標本采集同 A2。 F4． 3 標本接種培養(yǎng)及制片。 標本接種見 A5． 1，置 35℃過夜培育后，倒掉維持液，用消化液（ 1 份 %胰酶 +4 份 Versene）將細胞消化下來。用 PBS 洗一次，然后滴加于帶圈的玻璃片上，室溫干燥，冷丙酮固定。同法制備未經感染的正常 MDCK 細胞片即為正常對照細胞。 F4． 4 間接免疫熒光法 見 F3． 3。 F4． 5 間接免疫酶染法 F4． 5． 1 加單克隆抗體同 F3． 3． 2。 中國最大的管理資源中心 30 F4． 6 間接免疫酶染法 F4． 6． 1 加單克隆抗體同 F3． 3． 2。 F4． 6． 2 加適當稀釋度的羊抗鼠酶標結合物，濕盒中置 37℃ 1h，用 PBS 洗兩次10 min。 F4． 6． 3 加鄰苯二胺底物溶液，其配制法為： 4mg 鄰苯二胺 +10ml 磷酸 —檸檬酸緩沖液 +15ul H2O2。 磷酸緩沖液配制法為：先分別配制 氫二鈉，然而，分別按 和 相混，再加入等容量（ 50ml）去離子水，混勻即為 磷酸 — 檸檬酸緩沖液。 加入底物液 35min 即可觀察結果。 F4． 6． 4 結果觀察 于倒置顯微鏡下觀察（觀察時細胞要濕，如果細胞已干，可以加入一滴自來水 ）。觀察到棕紅色深染細胞，根據(jù)觀察到此細胞多少，記錄為 ++++， +++， ++，+， 177。 ， — 。以觀察到一個加號以上深染細胞判為陽性；有時可觀察到單個深染細胞被無色或淡紅色細胞所包圍，而正常細胞呈無色或淡紅色，亦可判為陽性。 F5 逆轉錄多聚酶鏈式反應（ RTPCR）對流感診斷和流感病毒株鑒定 RTPCR 為一種很有用的技術，它能測出非常低水平的流感病