【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 胞形成一個(gè)小團(tuán)，但邊緣不光滑，四周有小凝塊者為 +。 紅細(xì)胞于孔底形成一個(gè)小團(tuán)，邊緣光滑并有立體感，將板傾斜片刻，就可見(jiàn)紅細(xì)胞滑動(dòng)象人的眼淚滴樣者為 — 。但用豚鼠或人“ O”型紅細(xì)胞時(shí)常見(jiàn)不到孔底形成一個(gè)小團(tuán)和眼淚滴 樣結(jié)果出現(xiàn)。 “ 177。 ”即為可疑，計(jì)算時(shí)以“ — ”（陰性）處理。 C4． 3 紅細(xì)胞凝集滴度計(jì)算 結(jié)果以 ++為終點(diǎn)，亦即一個(gè)凝集單位。也就是說(shuō)最高稀釋度病毒能引起 ++號(hào)的紅細(xì)胞凝集為終點(diǎn)，此稀釋度的倒數(shù)為紅細(xì)胞凝集滴度，簡(jiǎn)稱血凝滴度。 下面以表 1 為例，進(jìn)行計(jì)算。 表１ 紅細(xì)胞凝集單位計(jì)算 標(biāo)本號(hào) 病毒稀釋度 滴度 備注 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ — — 480 取均數(shù) 2 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + — 560 小 1/8 3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ — 640 不必算 4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ — 800 大 1/4 5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ — 640 先整后算 6 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 1280 或 ≥ 1920 7 — — — — — — — — 10或≤ 口訣： 1． 先整后算。表 1 中， 14， 6 和 7 不必進(jìn)行整理，而 5 中，必須將 1： 640 處一個(gè)加號(hào)挪到 1： 320 處為 4 個(gè)加號(hào)，而 1： 160 處變成兩個(gè)加號(hào)，然后再進(jìn)行計(jì)算。 2． 兩個(gè)加號(hào)不用算。如表 1 中的 3，滴度為 640。 3． 小，小本身的 1/8。如表 1 中的 2， 1： 640 處僅一個(gè)加號(hào)，故血凝滴度一定小于 640，應(yīng)為 640640/8=560。 4． 大，大本身的 1/4。同理 4 中血凝滴度一定大于 640，應(yīng)為 640+640/4=800。 5． 兩個(gè)極端取中間。如 1， 1： 320 為 4 個(gè)加號(hào)， 1： 640 為陰性，應(yīng)為（ 320+640）/2=480。 C5 紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn) C5． 1 操作步驟 C5． 1． 1 血清中非特異抑制素的去除 受體破壞酶（ RDE）處理法： 1 容量血清，加 4 容量 RDE， 37℃ 水浴 16~18h，然后，置 56℃水浴 50min(以破壞殘余的 RDE 活性 )；置 4℃保存待用，勿凍存。經(jīng)此法處理的人、雞和山羊血清對(duì)甲、乙型流感病毒的非特異性抑制素均可完全去除。 RDE 處理對(duì)特異性抗體無(wú)影響。但有時(shí)經(jīng)處理的血清對(duì)測(cè)定的紅細(xì)胞有非特異性凝集。如發(fā)現(xiàn)時(shí)應(yīng)在處理后血清中加入終濃度為 20%的濃的測(cè)定用紅 細(xì)胞，搖勻，置室溫 60min 或 4℃過(guò)夜， 1000r/min 離心 5min，收存上清。對(duì)人血清抗體測(cè)定時(shí)，一般均經(jīng)此步處理。 中國(guó)最大的管理資源中心 17 C5． 1． 2 四個(gè)血凝單位抗原的制備 四個(gè)血凝單位計(jì)算：將血凝單位除以 4，如表 1 中標(biāo)本 1，它的四個(gè)血凝單位應(yīng)為： 480/4=120，即將標(biāo)本 1 進(jìn)行 1： 120 稀釋時(shí)，其稀釋液就是含四個(gè)血凝單位。配成后必須進(jìn)行復(fù)核測(cè)定：取一塊干凈的大孔塑料板，在前三孔，也可任意連續(xù)的三孔，每孔加入 生理鹽水，用一根 1ml 的吸管， 取 四個(gè)血凝單位的抗原放入第一孔，倍比稀釋至第三孔， 吸出 棄之，然后每孔加入 ml 生理鹽水，再加入 1%紅細(xì)胞懸液，搖勻，置室溫 30— 60 min后，觀察結(jié)果。正確結(jié)果，應(yīng)第一孔出現(xiàn) ++++，第二孔 ++，第三孔陰性或 +。如太大或太小都得重新配置。復(fù)核測(cè)定合格后，置 4℃ 或冰上，當(dāng)天使用。 C5． 1． 3 血抑測(cè)定 C5． 1． 3． 1 取一干凈的塑料板，標(biāo)明測(cè)定血清標(biāo)本，最后一孔為血清對(duì)照孔。 C5． 1． 3． 2 每孔加入 生理鹽水。 C5． 1． 3． 3 于第一孔和最后一孔中各加入 ml 經(jīng) RDE 處理過(guò)的血清，從第一孔起作倍 比稀釋至倒數(shù)第二孔，棄掉 。 C5． 1． 3． 4 將最后一孔輕輕吹打后，亦棄掉 。 C5． 1． 3． 5 于最后一孔加入 生理鹽水，其余各孔一律加入 四個(gè)凝集單位抗原，輕輕搖勻，置室溫 60 min。 C5． 1． 3． 6 各孔加入 1%的紅細(xì)胞懸液，搖勻置室溫 3060 min 后觀察結(jié)果。 C5． 1． 3． 7 對(duì)照組 血清對(duì)照 血清 +生理鹽水 血凝素對(duì)照 分別加入 4， 2， 1， 1/2 單位血凝素 +生理鹽水0..25ml 紅細(xì)胞對(duì)照 加生理鹽水 以上各對(duì)照組再分別加入 1%的紅細(xì)胞懸液 ，搖勻，在同等條件下觀察結(jié)果。 C5． 2 結(jié)果判斷 血凝的記錄同血凝測(cè)定法，以能完全抑制紅細(xì)胞凝集（簡(jiǎn)稱血抑）的最高血清稀釋度的倒數(shù)為血清抗體效價(jià)，即終點(diǎn)。以表 2 為例，加以說(shuō)明。 表 2 血抑測(cè)定結(jié)果 血清號(hào) 血清稀釋度 效價(jià) 1： 10 1： 20 1： 40 1： 80 1： 160 1： 320 1： 640 1： 1280 1 — — — — — — ++++ ++++ 320 2 — — — — — + ++++ ++++ 280 3 — — — — — ++ ++++ ++++ 240 4 — — — — — +++ ++++ ++++ 200 5 — — — — — ++++ ++++ ++++ 160 6 — — — — — + +++ ++++ 320 7 — — — — — — — — ≥ 1280 8 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 10 或≤ 5 同樣在計(jì)算抗體效價(jià) 之前，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行整理，方法同前。如 6 中，必須把 中國(guó)最大的管理資源中心 18 1： 320 處的一個(gè)加號(hào)移到 1： 640 處，使 1： 320 處變成“ — ”，而 1： 640 處變成“ ++++”。 根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算： X=Y+Y/4 Z X：血清效價(jià) Y：能引起血凝全抑制最高血清稀釋度的倒數(shù) Z： 4減去不能被抑制數(shù)（全抑制高一個(gè)稀釋度） 例如： 2號(hào)血清效價(jià)： X=Y+Y/4 Z=160+160/4（ 41） =280 C5． 3 交叉血抑測(cè)定和抗原比計(jì)算 為了確切了解抗原性變異的幅度，常用交叉血抑測(cè)定進(jìn)行抗原分析。測(cè)定中所用的免疫血清包括既往流行過(guò)的代表株和用新分離病毒制備的免疫血清。所用抗原都是和血清相應(yīng)的同株抗原。每個(gè)抗原均必須準(zhǔn)確調(diào)至四個(gè)單位，實(shí)驗(yàn)必須在同一條件下進(jìn)行。 根據(jù)公式計(jì)算抗原比： R=√ r1 r2 r1=甲血清對(duì)乙抗原的血抑滴度 /甲血清對(duì)甲抗原的血抑滴度 r2=乙血清對(duì)甲抗原的血抑滴度 /乙血清對(duì)乙抗原的血抑滴度 R 為抗原比，當(dāng) R=1 時(shí)，表明兩株間抗原性相同； R 時(shí)，表明兩毒株間抗原性無(wú)明顯差異； R 為 1/— 1/2 時(shí)表明兩毒株的抗原性有小差異， R 值越大，差異越大。 附錄 D （資料附錄） 神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗(yàn) D1 反應(yīng)原理： D1． 1 自由的 N乙酰神經(jīng)氨酸（ Nacetylneuraminic acid）經(jīng)神經(jīng)氨酸酶的作用，自胎球蛋白（ Fetuin）底物中釋放。 D1． 2 經(jīng)過(guò)碘酸鹽的氧化作用，將 N乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)化為 223。甲酰丙酮酸（ βformyl pyruvic acid） 。 D1． 3 223。甲酰丙酮酸經(jīng)硫代巴比妥酸的作用形成生色團(tuán)。 D1． 4 用有機(jī)溶劑提取生色團(tuán)，便可用分光光度計(jì)測(cè)定之，這樣可測(cè)知標(biāo)本中神經(jīng)氨酸酶活性，并可選擇用于神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)劑量。 神經(jīng)氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)是測(cè)定血清抑制標(biāo)準(zhǔn)量酶活性的效價(jià)。 NI 測(cè)定已成為流感病毒鑒定不可缺少的手段之一。因 NI 測(cè)定結(jié)果是流感病毒神經(jīng)氨酸亞型劃分的主要依據(jù)之一。有時(shí)該法也用于了解流感病毒 NA 抗原性變異和血清診斷等方面。 NI 測(cè)定不受血清中非特異性抑制素的影響，但易受病毒粒血凝素抗體的影響即空間干擾。為解決這弊端，在流感病毒鑒定中 ，常使用單價(jià)血清（只針對(duì) NA 的）或基因重配毒株所制備的免疫血清（如使基因重配株NA 抗原為 N2 或 N1，其 HA 抗原為馬 1（ H7）亞型的）。 D2 材料 中國(guó)最大的管理資源中心 19 D2． 1 試劑配制 D2． 1． 1 磷酸緩沖液 甲液： 400mmol/L 正磷酸氫二鈉 乙液： 400mmol/L 正磷酸二氫鈉 丙液： 60 mmol/L 氯化鈣 甲液 19 ml 加乙液 81 ml 混之，將 pH 調(diào)至 177。 ， pH 偏高用乙液調(diào)之，偏低用甲液調(diào)之。而后加入 1 ml 丙液，此時(shí) CaCl2的終濃度為 6 mmol/L。置 4℃或室溫保存。 注 ： 常常加入 CaCl2 后，緩沖液出現(xiàn)沉淀，故我們一般不加它。甲、乙液為200 mmol/L。 D2． 1． 2 胎球蛋白 用蒸餾水把冰凍干燥的胎球蛋白配制成 4850mg/ml的溶液（讓其緩慢溶解）?；?qū)⒈鶅霰４娴奶デ虻鞍兹芤河萌ルx子水配成工作液。 D2． 1． 3 過(guò)碘酸鹽試劑 4． 28g過(guò)碘酸鈉 (NaIO4)溶于 38ml 去離子水中，加 62 ml 濃正磷酸，充分混合，存于帶玻璃塞的棕色瓶中。 D2． 1． 4 砷試劑 10 g 亞砷酸鈉（ NaAsO4）和 g 無(wú)水硫酸鈉加去離子水至 100 ml，混之，加 ml 濃硫 酸，使之完全溶解。 D2． 1． 5 硫代巴比妥酸試劑 g 硫代巴比妥酸和 g 無(wú)水硫酸鈉加入去離子水至 200 ml，在沸水浴中加熱溶解，用前新配，使用期為一周。 D2． 1． 6 生理鹽水 NaCl 加入 100 ml 去離子水，溶解，置室溫保存。 D2． 1． 7 酸化正丁醇試劑 95ml 正丁醇（ Butanol）中加入 5ml 濃鹽酸，存在帶塞棕色瓶中置室溫保存。 D2． 1． 8 玻璃器材和煮鍋等。 D3 操作步驟 D3． 1 神經(jīng)氨酸酶活性測(cè)定 D3． 1． 1 病毒溶液用生理鹽水作倍比稀釋，一般新 鮮尿囊液抗原作 1： 2— 1：32 稀釋已足夠。稀釋好的病毒，每個(gè)稀釋度加一管， 。于底物對(duì)照管中加入 (不加病毒 )。 D3． 1． 2 于每管中加入 的 PBS(因流感病毒神經(jīng)氨酸酶最適 pH 為),每管中再加入 ml 胎蛋白溶液 ,充分混合后置 37℃水浴1618h。 注 :加每樣試劑均應(yīng)送至管底 。我們稀釋病毒有時(shí)直接用 200 mmol/L 的 PBS,每管加 ,這樣做不正規(guī) ,但操作方便，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大 。有些流感病毒株 NA活性很高， 于 37℃水浴 24h(與底物一起 )就可測(cè)出酶活性 . D3． 1． 3 從水浴中取出試管，放室溫冷卻，每管加入 過(guò)碘酸鹽試劑，充分混合，置室溫 20 min（這個(gè)時(shí)間要精確）。 D3． 1． 4 每管緩慢加入 1ml 砷試劑。由于碘的釋放出現(xiàn)棕色，搖蕩試管待棕色 中國(guó)最大的管理資源中心 20 消失乳白色出現(xiàn)為止。必要時(shí)試驗(yàn)可在此步暫停，測(cè)定物置 4℃冰箱保存。其余測(cè)定步驟一律不能暫停）。 D3． 1． 5 每管加入 硫代巴比妥酸試劑，充分混合。該試劑在煮沸溶解時(shí)趁熱加入管中。 D3． 1． 6 立刻將試管置煮沸的水浴中煮 15min，此時(shí)所出現(xiàn)的紅色 即為神經(jīng)氨酸酶活性的反應(yīng)。 D3． 1． 7 將試管置冰水中冷卻，然后加入 4ml 酸化正丁醇，塞上干凈的膠皮塞，用手劇烈搖蕩 12min，使紅色轉(zhuǎn)到丁醇層。 D3． 1． 8 1500r/min 離心 5min,上層達(dá)到透明不混濁。 D3． 1． 9 將分光光度計(jì)波長(zhǎng)調(diào)至 549nm，用底物對(duì)照管調(diào)零點(diǎn)，而后，從高稀釋度到低稀釋度，將管中的上層溶液吸置透光池中，依次測(cè)出并記錄它們的吸光度 A 值（曾稱光密度 OD 值）， A 值越高表明酶活性越強(qiáng)。 D3． 1． 10 一個(gè)酶單位確定：一般將 A 值為 的病毒稀釋度作為一個(gè)酶單位 。我們常將 A 值為 的病毒稀釋度為一個(gè)酶單位，用于酶活性抑制測(cè)定。一個(gè)酶單位確定方法如下：將上述測(cè)到的數(shù)據(jù)作直線回歸，找出 A 值為 的病毒稀釋度。但也可以下方法來(lái)確定： （ 1） 取一張半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙，其縱軸（對(duì)數(shù)）表示病毒