膠體金快速免疫診斷技術(shù)(編輯修改稿)
2024-11-19 22:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH。 ②于100ml 金溶膠中加入最佳標記量的蛋白質(zhì)溶液攪拌2～3分鐘。 ③加入5ml1%PEG20000溶液。 ④于10000～100000g離心30～60分鐘小心吸去上清液（切忌傾倒）。 ⑤將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復，濃度以 A540nm=1.5左右為宜，防腐置4℃保存。 ⑥包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G200柱進行凝膠層析分離純化，以含 0.1%BSA的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2。 以上操作中應注意，一切溶液中不應含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預處理。,膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定 平均直徑的測量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復染后觀察。計算100個金顆粒的平均直徑。 OD520nm值測定：用PBS液（含1%BSA）將膠體金蛋白試劑作1:20稀釋，OD520＝0.25左右。一般應用液的OD520應為0.2～0.4。 金標記蛋白的特異性與敏感性測定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測相應的抗原或抗體，對金標記蛋白的特異性和敏感性進行鑒定。,膠體金蛋白結(jié)合物玻璃纖維素膜制備,膠體金標記的鼠抗人IgG放入玻璃纖維素膜浸泡10分鐘，取出至37度烤箱中烤干，熱合封口，置4攝氏度冰箱備用。(實驗階段） 用噴點儀將膠體金標記的鼠抗人IgG噴在玻璃纖維素膜上,真空干燥2 h 。 （生產(chǎn)階段）,選擇NC膜,NC膜的選擇 爬速(???秒/4cm)對靈敏度的影響 通過同一T線噴點位置時, 金溶液通過的速度是快速膜慢速膜. 那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應時間也就越短, 讀數(shù)快, 那么靈敏度也就越低. 反之, 反應時間長, 讀數(shù)慢, 也就靈敏度高。 同時還有一個問題是, 反應時間越長, 發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大, 所以過長時間的反應不一定就能夠真正的提升靈敏度.。所以這里就有一個讀數(shù)時間/反應靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡. 不同膜廠家的產(chǎn)品 (Whatman,Millipore,Sartorius) 大致為: 135s和180s,抗原、抗體包被固相NC膜的制備,包被流腦抗原濃度篩選（T線） 抗原用PBS 梯度稀釋, 釋后用1μl移液器點在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 備用 。 包被抗鼠IgG濃度篩選（C線） 抗鼠IgG抗體用PBS 梯度稀釋, 釋后用1μl移液器點在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 備用。,溶液噴點 (噴點演示:BIODOT XYZ系列噴點儀器),C\T線溶液前處理: 1.過濾,0.22um孔徑濾膜 2.離心1萬轉(zhuǎn)10分鐘 C\T線噴點工藝與接觸劃點工藝比較 因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面,而膜本身的物理性質(zhì)為軟脆,劃管會在其表面留下印痕.劃痕容易對層析的金標復合物形成阻力,導致假陽性。,干 燥,干燥方法的比較 37度干燥４h：顆粒感較強，易中間白，周邊深。 低溫真空干燥３h：顏色均一，只是兩端稍淺，有一定的柔性。,試紙條組裝,在干
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