【文章內(nèi)容簡介】 重變異不超過20％。對照組動物數(shù)，可以與給藥組相同，也可按公式計算：對照組動物數(shù)：給藥組動物數(shù)x劑量組數(shù)的平方根。 試驗周期3個月之內(nèi)的，嚙齒類宜用6—8周齡的大鼠，每組數(shù)量不少于20只；非嚙齒類可用6—10月齡的犬，每組數(shù)量6只；試驗周期3個月以上的，嚙齒類宜用6周齡的大鼠，每組數(shù)量應增至3040只。非嚙齒類可用46月齡的犬，每組數(shù)量6只。確定每組動物數(shù)的原則，主要考慮藥物毒性致實驗動物死亡數(shù)，實驗中處死動物的批次和實驗結束時及停藥后觀察恢復(huīf249。)狀況所需能用于統(tǒng)計分析的動物數(shù)。,第二十頁，共五十三頁。,四、飼養(yǎng)條件 (1)通風良好：動物飼養(yǎng)室的換氣次數(shù)和氣流速度能控制在10～15次／h和13—18cm／s較好，目的是利于動物的散熱及排除臭氣、粉塵和微生物，又不明顯影響室內(nèi)的溫、濕度和動物的耗能。 (2)光照規(guī)律：因生物節(jié)律對動物的反應性有明顯的影響，光照會影響動物的生物節(jié)律從而影響不同批次之間的毒性對比。大鼠、小鼠應為12h明，12h暗；倉鼠應是14h明，l0h暗。 (3)環(huán)境清潔：微生物或寄生蟲感染等，均叫能影響毒性試驗的結果。有條件者應盡可能選用清潔級、SPF級試驗設施(sh232。shī)。 (4)溫、濕度適中且穩(wěn)定：常溫動物在15—33C下，體溫波動在1. 5C以內(nèi)。濕度是種潛熱，宜控制在30％—70％。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動物的生理狀況未受影響，同樣可以導致動物對外環(huán)境變化的抵抗力降低，影響毒性實驗結果。 (5)室內(nèi)噪聲最好在50dB以下：雌雄分養(yǎng)，不宜擁擠，必要時(如摻飼給藥或需精確測定飲食量時)單籠飼養(yǎng)，但要注意單養(yǎng)和群養(yǎng)的動物劉藥物的反應是有差異的。各劑量組和對照組的飼養(yǎng)條件應等同。室內(nèi)飼養(yǎng)另種動物，或其他飼養(yǎng)條件的突然改變，均可引起實驗動物應激反應，從而影響毒性實驗結果。 (6)食物應清潔，無霉變：食物中的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等營養(yǎng)成分要符合各種動物的生理需求目恒定，因有時營養(yǎng)成分對藥物的毒性也有很大的影響。飲水要潔凈，防止病源微生物、重金屬或其他有毒物質(zhì)的污染。,第二十一頁，共五十三頁。,第二節(jié) 受試藥物 一、藥物形式 應與臨床試驗用制劑完全—致(除可以不含賦形劑外)。三類以下的中藥新藥復方制劑，體積較大，以不含賦形劑如中藥浸膏作受試物為宜。固體制劑灌胃給藥，不溶于水的可制成餛懸液?；鞈乙阂鶆颍腆w物先磨成80目以上(yǐsh224。ng)的細粉，再加1％左右的羧甲基纖維素鈉或10％左右阿拉伯膠助懸，冰箱放置，臨用前搖勻，短期內(nèi)用完，以免受試物活性下降。,第二十二頁，共五十三頁。,二、給藥途徑和方法 給藥途徑應盡量與臨床一致。口服藥物可灌胃或摻飼給藥。灌胃給藥有血藥高峰期：摻飼給藥血藥濃度波動較小，維持時間較長。靜脈注射或肌內(nèi)注射給藥可以肌內(nèi)注射或皮下注射。腹腔注射時大部分藥物依然是首先入肝，因此不能完全代替臨床注射給藥途徑。 皮下注射，大鼠每l00g體重不超過1ml，小鼠為0．1—0．3ml／l0g(體重)。肌內(nèi)注射，大鼠每腿不超過0．5ml，小鼠每腿不超過0．3ml。注射給藥應嚴格(y225。ng233。)消毒，并需經(jīng)常變換注射點以減少對局部的刺激，還應考慮藥液的酸堿度和滲透壓。 灌胃容積，大鼠一般每100g體重1—2ml，小鼠為0．10. 3ml／l0g(體重)。犬等大動物常采用口服或摻飼給藥。從營養(yǎng)考慮摻飼藥量不宜超過攝食量的5％。摻飼給藥(摻入飼料或飲水中給藥)應有保證攝入規(guī)定藥量的措施，還應有均勻混合、穩(wěn)定性及質(zhì)量檢杳等措施。對中藥復方制劑很難做到這點，必須摻飼，給藥時，采用現(xiàn)喂現(xiàn)摻的方法較好。 長期毒性實驗的給藥量應根據(jù)動物體重的變化不斷調(diào)整，一般每期稱量體重并調(diào)整藥量1次。各劑量組應采用等容量不同濃度給藥。,第二十三頁，共五十三頁。,三、給藥分組 (1)應設3個或9個以上的劑量組。高劑量組應有少數(shù)動物出現(xiàn)嚴重毒性反應或死亡(不超過20％)，低劑量組應相當或略高于藥效學試驗的有效劑而不出現(xiàn)毒性反應，中劑量組在高低劑量組之可以等比關系排列。中藥—般毒性較低，體積較大。在即使最大限度提高劑量(技術上能投給的最高劑量)仍不能使動物中毒死亡的情況下，高劑量組應相當于臨床用量50倍以上，雖低不能低于臨床劑量的30倍(按千克體重計算)，且必須高于藥效學實驗(sh237。y224。n)的高劑量組。 (2)如采用臨床試驗用制劑，對照組應給等容量的賦形劑，應注意有時賦形劑或溶劑的種類和用量會影響藥物的實驗結果。如采用不含賦形劑制劑，對照組可給等容量的水等溶劑。如賦形劑或溶劑可能產(chǎn)生毒性時，還需另設空白對照組。,第二十四頁，共五十三頁。,四、給藥周期 不應少于臨床療程的1倍?！苄滤帉徟k法中藥藥理(y224。olǐ)毒理研究的技術要求≥中規(guī)定：中藥三、四類新藥，處方中各味藥材均符合法定標準，無毒性藥材，無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學處理(水、乙醇粗提除外)，難以測出LD50而給藥量大于20g生藥／kg(體重)，臨床用藥期為1早期以內(nèi)者町免做長期毒性實驗。1星期以上者及需反復應用的藥物，可選用大鼠進行長期毒性實驗。對一、二類新藥以及含有毒藥材、非法定標準藥材或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四類中藥新藥，長期毒性實驗應用嚙齒類和非嚙齒類兩種動物進行。給藥周期：嚙齒類一般不超過6個月，非嚙齒類不超過9個月。,第二十五頁，共五十三頁。,第三節(jié) 觀察指標 一、檢測(jiǎn c232。)次數(shù) 試驗周期在3個月以內(nèi)的，末次給藥后24h，每組活殺部分動物(1／2—2／3)，檢測各項指標，余下動物停藥繼續(xù)觀察2—4星期之后，同樣活殺全面檢測，以了解可能出現(xiàn)的遲緩性毒忭和毒性反應的可逆程度。試驗周期在3個月以上的，可增加在實驗中期活殺少量動物(如高劑量組和對照組)檢測各項指標。,第二十六頁，共五十三頁。,二、檢查項目 (一)一般檢查 (1)長期毒性試驗的癥狀發(fā)生得快慢不—。因此，在給藥開始l星期內(nèi)須嚴密觀察，以后每日至少觀察一次行為活動、外觀體征、糞便性狀(x236。ngzhu224。ng)等。非嚙齒類動物還可以觀察劉刺激的反應等更高一層的行為變化。 (2)體重，反映動物的生長和一般健康狀況，也是反映毒性的敏感指標，同時給約量的調(diào)也需根據(jù)體重的變化，因此至少每星期稱量記錄1次。 (3)攝食量的測定應與體重變化同時測定。攝食量(g)／體重增加(g)是說明體重變化原因的重要指標。 (4)攝水量的測定有時是必要的。對可能影響飲水量、尿量的受試藥物，或摻入飲水紿藥時，應測定攝水量。 (5)死亡，是中毒最明顯的表現(xiàn)，但須注意與自然死亡或意外死亡的區(qū)別．應及時進行剖檢和記錄。對瀕死動物應立即處死，剖檢和進行血液學、血液生化及病理組織學檢查。,第二十七頁，共五十三頁。,(二)實驗室檢查 1．血液學 血常規(guī)(纖細胞和網(wǎng)織纖細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、白細胞計數(shù)、白細胞分類、血小板計數(shù))、出凝血時間等。反應骨髓造血功能，外周各類血細胞的受損或活動情況，凝血機制的影響程度等。 2．尿液 尿量、尿常規(guī)(尿蛋白、尿糖、尿血紅蛋白等)檢查，反應腎臟功能、心臟和內(nèi)分泌功能。 3 血液生化 血液生化檢測反應動物體內(nèi)各系統(tǒng)、各組織器官的功能狀態(tài)或受損情況。若能預測毒性作用的靶器官，可以有目的地選擇指標，否則(fǒuz233。)原則上應盡可能多地進行檢測。嚙齒類受到血液量的限制，非吶齒類雖不受采血量限制，但實際上不可能無限制地選擇檢測項目，因此，—般首先選擇下列指標以初步廠解受試藥物對機體的毒性概況，為較深入地研究受試藥物的毒性指明方向。,第二十八頁，共五十三頁。,(1)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶：主要反應肝臟受損情況(q237。ngku224。ng)，其次為由心臟病變引起的肝臟淤膽或郁血。 (2)總膽紅素：反應肝臟解毒功能和膽道排泄狀況或溶血等。 (3)堿性磷酸酶(ALP)：增高反應骨骼受到影響或肝臟排泄受阻或甲狀旁腺功能亢進。 (4)尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)：增高反應腎臟功能受損或蛋白質(zhì)分解增強或脫水。 (5)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶：主要心臟受損情況。 (6)總蛋白(TP)：用以求出球蛋白含量。 (7)白蛋白：常見其濃度降低，反應肝臟合成功能或胃腸消化吸收受影響后的攝 入不足或腎臟受損丟失過多。其濃度增高見于脫水及血液濃縮。 (8)球蛋白：常見是其濃度增高，反應受到感染或機體免疫功能亢進。其濃度降