臨床基因擴增檢驗實驗室臨床實驗報告管理制度五篇(編輯修改稿)
2024-11-04 17:06 本頁面
【文章內容簡介】 傾向于使用一步法：即使用在擴增反應緩沖液條件下具有逆轉錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行逆轉錄，其較cDNA合成后再開蓋以調節(jié)緩沖液或加入聚合酶進行擴增發(fā)生污染的可能性降低。待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進行PCR擴增。(三)擴增區(qū)下述工作在本區(qū)內進行：DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內進行。不能從本區(qū)再進入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內的走動。如有加樣則應在超凈臺內進行。打開預處理過的反應混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。(四)擴增產物分析區(qū)下述操作在本區(qū)內進行：擴增片段的測定。核酸擴增后產物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標記或非同位素標記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法等。目前國內的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法，即PCRELISA方法，也有膜上探針雜交方法。本區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCRELISA方法檢測擴增產物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實驗室內傾倒，而應至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應注意實驗人員的安全防護。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負壓條件或減壓情況下(如安裝排風扇)可減少擴增產物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性。二、臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證涉及到整個基因擴增檢驗的所有階段，即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的結果報告等。(一)標本的采集常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應使用一次性密閉容器，如真空采血管。當使用非密閉采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。臨床用于RNA(如HCV RNA)擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理，并盡快(3小時以內)分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內分離血清。(二)標本的穩(wěn)定化處理用于DNA擴增檢測的標本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標本應及時送至實驗室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩(wěn)定化處理，如流行病學調查的現(xiàn)場采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經上述穩(wěn)定化處理后，標本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應的逆轉錄PCR測定方法來評價。(三)標本的運送標本采集后必須盡快送至實驗室。經過適當穩(wěn)定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經GITC穩(wěn)定化處理的標本。通常在運送時，應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本，如果未經穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。(四)標本的貯存臨床體液標本如血清/血漿等可于70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris1 mmol/L EDTA緩沖液(pH )中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。(五)標本的處理(核酸提取)標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前，應對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。通常，核酸制備質量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標本
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