20xx年醫(yī)學(xué)專題—不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)(編輯修改稿)
2024-11-04 14:34 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ~ 4 個內(nèi)皮細(xì)胞， 以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù)2 ~ 5 天。,第二十八頁，共七十頁。,3．毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)： (1) 初代培養(yǎng)2 ~ 3 天后，鏡下確認(rèn)幾個毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起； (2) 鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時，可用顯微(xiǎn wēi)細(xì)針在倒置顯微(xiǎn wēi)鏡下挑除；用細(xì)胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養(yǎng)皿蓋進(jìn)行，但時間不宜過長(15 ~ 20 分鐘)；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無菌膠刮刮除；,第二十九頁，共七十頁。,(3) 用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞； (4) 剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小(5 ~ 20 個細(xì)胞) 而少時，生長增殖常變得緩慢或完全不生長，此時需加入(jiār249。)3T3等飼細(xì)胞；飼細(xì)胞接種量為4000 細(xì)胞／cm2； (5) 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基； (6) 接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)(飼細(xì)胞死亡被淘汰)，細(xì)胞增殖生長匯合后，按1:5 傳代。,第三十頁，共七十頁。,第三十一頁，共七十頁。,二、結(jié)締組織(ji233。d236。zǔzhī)類細(xì)胞培養(yǎng),(一) 成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 包括人在內(nèi)的各種成纖維細(xì)胞都很容易(r243。ngy236。)培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時的副產(chǎn)物，極易獲得。 用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒包皮是培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的很好對象。,第三十二頁，共七十頁。,小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)(p233。iyǎng)條件,12.5~14.5d胎齡的小鼠胎兒分離效果最好； 最佳培養(yǎng)基為DMEM添加15%小牛血清； 第3代細(xì)胞增殖最旺盛； 室溫條件(ti225。oji224。n)下，0.125%胰蛋白酶消化時間以8~10min為宜。 在培養(yǎng)ES細(xì)胞時，應(yīng)選擇第3~5代的小鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。,第三十三頁，共七十頁。,小鼠成纖維細(xì)胞(x236。bāo)； 細(xì)胞(x236。bāo)來源：swiss小鼠胚胎,第三十四頁，共七十頁。,第三十五頁，共七十頁。,(二) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。 巨噬細(xì)胞容易獲得，便于(bi224。ny)培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。但屬不繁殖型細(xì)胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活2 ~ 3周，因之多用作初代培養(yǎng)。 巨噬細(xì)胞也能建成無限細(xì)胞系；大多來自小鼠，如P388DJ774A．RAW30Cr. 1 等。,第三十六頁，共七十頁。,1．培養(yǎng)技術(shù)(j236。sh249。)要點(diǎn)： [來源和取材] 巨噬細(xì)胞可來源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。 實(shí)驗(yàn)多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動物腹腔取材最常用。用40μg 的PHA 注入腹腔中，能產(chǎn)生6 ~ 8106 個細(xì)胞，而且無刺激性，效果較好。,第三十七頁，共七十頁。,2．培養(yǎng)方法： 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各種方法和各種來源獲取細(xì)胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用。人的材料除來源不同外，培養(yǎng)方法大同小異。 [程序] (1) 實(shí)驗(yàn)前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫基乙酸肉湯1ml (勿注入腸內(nèi))； (2) 引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3 ~ 5 秒； (3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定(g249。d236。ng)四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁； (4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動；,第三十八頁，共七十頁。,(5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)； (6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中， (4℃)離心10 分鐘后，去上清，加10 ml Eagle 培養(yǎng)基； (7) 計數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生20 ~ 30106 細(xì)胞，其中90％為巨噬細(xì)胞； (8) 為獲取3105 個貼附細(xì)胞／平方厘米，需接種2.5106／m1； (9) 為純化培養(yǎng)(p233。iyǎng)細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小時后，去除培養(yǎng)(p233。iyǎng)液，用Eagle 液沖洗1 ~ 2 次后，再加新Eagle 培養(yǎng)(p233。iyǎng)液置37℃ CO2 溫箱中培養(yǎng)。,第三十九頁，共七十頁。,第四十頁，共七十頁。,三、肌組織(zǔzhī)細(xì)胞培養(yǎng),以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實(shí)用。 (一) 骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng) 動物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料。取材常用生后1 ~ 2 天的乳鼠(Wistar 大鼠更好)。 (1) 取材：殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成0.3 ~ 0.5 厘米小塊； (2)消化：用不含鈣鎂離子的Hanks 液配的0.25％胰蛋白酶(y237。 d224。n b225。i m233。i)消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過，合成培養(yǎng)基加10％小牛(或馬)血清培養(yǎng)，為促進(jìn)分化可加1％ 的胎汁；,第四十一頁，共七十頁。,(3)接種：細(xì)胞接種量為2106/皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化。
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