醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則(編輯修改稿)
2024-10-25 07:28 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對(duì)紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，最好是照射過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。(二)標(biāo)本制備區(qū)下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)?？赏ㄟ^(guò)在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加 1入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。用過(guò)的加樣器吸頭必須放入專門(mén)的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室桌椅表面每次工作后都要清潔，實(shí)驗(yàn)材料(原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取中的標(biāo)本與試劑的混合液等)如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)適當(dāng)?shù)淖贤庹丈?254nm波長(zhǎng)，與工作臺(tái)面近距離)適合于滅活去污染。可移動(dòng)紫外線管燈可用來(lái)確保工作后對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面的充分照射。樣本處理對(duì)核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開(kāi)展臨床標(biāo)本檢測(cè)前對(duì)提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏DNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對(duì)容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個(gè)以上的溫育裝置。cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開(kāi)蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。待測(cè)RNA的cDNA拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(三)擴(kuò)增區(qū)下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開(kāi)反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。不能從本區(qū)再進(jìn)入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。如有加樣則應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開(kāi)預(yù)處理過(guò)的反應(yīng)混合液時(shí)必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是在打開(kāi)反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒。可使用體積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺(tái)面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺(tái)。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過(guò)的加樣器必須注意清潔消毒。完成操作及每天工作后都必須對(duì)實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測(cè)定。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法等。目前國(guó)內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCRELISA方法，也有膜上探針雜交方法。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此必須注意避免通過(guò)本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCRELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過(guò)的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負(fù)壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的所有階段，即測(cè)定分析前的標(biāo)本采集處理、測(cè)定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測(cè)定后的結(jié)果報(bào)告等。(一)標(biāo)本的采集常用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來(lái)自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時(shí)必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ髅蟪：胁灰资Щ畹腞NA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。臨床用于RNA(如HCV RNA)擴(kuò)增檢測(cè)的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時(shí)以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。(二)標(biāo)本的穩(wěn)定化處理用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測(cè)定的標(biāo)本有時(shí)必須進(jìn)行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場(chǎng)采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。對(duì)于特定的檢測(cè)項(xiàng)目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定方法來(lái)評(píng)價(jià)。(三)標(biāo)本的運(yùn)送標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過(guò)適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過(guò)郵寄運(yùn)送。如用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)的EDTA抗凝全血標(biāo)本及用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。通常在運(yùn)送時(shí)，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測(cè)的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。(四)標(biāo)本的貯存臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于70℃下長(zhǎng)時(shí)間貯存。用于DNA測(cè)定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris1 mmol/L EDTA緩沖液(pH )中4℃保存。用于RNA測(cè)定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在20℃即可。用GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天。(五)標(biāo)本的處理(核酸提取)標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測(cè)成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行充分評(píng)價(jià)以驗(yàn)證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來(lái)源于標(biāo)本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過(guò)程中殘留的有機(jī)溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質(zhì)對(duì)其后的Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測(cè)定。當(dāng)標(biāo)本為痰時(shí)，則必須先進(jìn)行液化處理，再提取核酸。需注意
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