【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 置振蕩搖床上，于 35~37℃下培養(yǎng) 3~5d，進(jìn)行“富集”培養(yǎng)。將上述富集液點(diǎn)布于培養(yǎng)皿中的滅菌濾紙上，在 35~37℃下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落，挑到麥芽汁培養(yǎng)7~8d。將分純獲得的菌株，經(jīng)過(guò)反復(fù)的搖床 發(fā)酵試驗(yàn)，篩選出高產(chǎn)檸檬酸的菌株。 （ 3）保藏：菌種孢子移接于麥芽汁瓊脂斜面后，于 35℃下培養(yǎng) 7~8d，待長(zhǎng)滿(mǎn)黑褐色孢子后，放到 2~4℃冰箱中保藏，此法可保藏 1~2個(gè)月。如果要長(zhǎng)期保藏則必須定期進(jìn)行移種或采用沙土管等載體吸附進(jìn)行菌體長(zhǎng)期保藏。 孢子直接接種的優(yōu)點(diǎn)： 孢子直接接種即所謂的一級(jí)接種工藝。目前大多是作為種子罐種子（二級(jí)種子）出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題或因生產(chǎn)中的突發(fā)事件而二級(jí)種子不能及時(shí)供應(yīng)時(shí)的一個(gè)補(bǔ)救措施。實(shí)際上孢子直接接種完全可以作為正常生產(chǎn)工藝使用，其優(yōu)點(diǎn)如下： 直接接入發(fā)酵罐培養(yǎng)液中 孢子數(shù)與接進(jìn)種子罐的孢子數(shù)相同。則與二級(jí)接種所產(chǎn)生的生物量基本相當(dāng)，因?yàn)樵诜N子罐內(nèi)不會(huì)再繁殖新孢子。 我國(guó)現(xiàn)用菌種，種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)配方基本一致，一級(jí)接種從孢子開(kāi)始一直處于同一生長(zhǎng)條件，生長(zhǎng)環(huán)境隨孢子的成長(zhǎng)而變化，即始終為菌體生長(zhǎng)創(chuàng)造一個(gè)有利的環(huán)境。 如培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件出現(xiàn)不可預(yù)見(jiàn)的異常因素，則孢子比菌球體更能適應(yīng)。 能保持較幼的種齡，前期產(chǎn)酸稍慢，培養(yǎng)基 pH＞ 的時(shí)間延長(zhǎng)，有利常數(shù)的充分糖化，后期產(chǎn)酸較快，后勁會(huì)較足，則殘?zhí)禽^低。 減少一次接種操作也就減少一次染菌機(jī)會(huì)。同時(shí)節(jié)約了相應(yīng)設(shè)備的投資及能耗 。 但一級(jí)接種發(fā)酵前期，容易染菌，一旦發(fā)現(xiàn)染菌，或菌種出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題時(shí)，則培養(yǎng)基必須重新滅菌，而種子罐則靈活得多。當(dāng)然這種事故的概率很低，其次則是孢子在大罐生長(zhǎng)期的攪拌功率消耗問(wèn)題。所以任何事物都不是絕對(duì)的。 檸檬酸生產(chǎn)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子質(zhì)量的要求 : (1)擴(kuò)培流程：國(guó)內(nèi)檸檬酸生產(chǎn)的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)普遍采用 原種→斜面培養(yǎng)→三角麩曲培養(yǎng)→直接接入發(fā)酵罐發(fā)酵 （ 2）斜面菌種的培養(yǎng) :麥芽汁斜面制備，取麥芽粉加 4 倍質(zhì)量的水，在 55~60℃下保溫糖化 3h 左右，時(shí)常攪拌，以碘液檢查黃色為終點(diǎn)。濾去麥芽渣，用水調(diào)至 10176。 Bx 糖度，煮沸，再過(guò)濾一次，獲得澄清的麥芽汁。取少量澄清的麥芽汁加入 20g/L 瓊脂，裝入試管，在 表壓下滅菌 30min，擺成斜面，接入菌種，于 35℃下培養(yǎng) 7~8d，并做生產(chǎn)性能試驗(yàn)。 （ 3）麩曲三角瓶培養(yǎng) A、麩曲培養(yǎng) 取新鮮麩皮，用 60 目篩子去細(xì)粉，以減少常數(shù)含量。按麩皮：水 =1:~ 比例加入水，拌勻至無(wú)干份無(wú)結(jié)團(tuán)想象。拌勻后，將裝入 1000mL 或 2021mL 三角瓶中，每只 1000mL 三角瓶裝濕麩皮約 40g， 2021mL 三角瓶裝濕麩皮約 100g?；蛴盟贷熎け砻妫瑪D去水分，至手抓 有水而不下滴為宜，按適當(dāng)量裝瓶。用 8層紗布封扎瓶口，在 表壓下滅菌 40~60min，趁熱搖散，冷卻至 35℃，培養(yǎng) 1d。未發(fā)現(xiàn)氣味異?；蛉揪?，即可使用。 在無(wú)菌室中，于無(wú)菌操作條件下，每一個(gè)三角瓶上接入 1~2 環(huán) 已活化好的斜面菌種孢子，或 2ml 斜面菌種的孢子懸浮液，于 30~32℃下培養(yǎng) 16~20h 后，白色小菌落已蓋滿(mǎn)曲層表面，這時(shí)應(yīng)搖瓶一次，使培養(yǎng)基疏松、鋪平、繼續(xù)培養(yǎng)再經(jīng) 4~6h，即約培養(yǎng) 24h 后，可看到培養(yǎng)基結(jié)成塊狀，白色菌絲生長(zhǎng)旺盛，但后停止。搖瓶時(shí)必須充分搖勻，使結(jié)塊的培養(yǎng)基疏散，鋪平 后，繼續(xù)培養(yǎng)。待長(zhǎng)出的黑子孢子布滿(mǎn)豐盛后，即可使用。 此麩曲可直接作為種子罐種子，也可以作為二級(jí)種子，再擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大量為 200 倍，即一瓶麩曲可接種 200 只相同的三角瓶。 B、麩曲質(zhì)量： ①孢子稠密、整齊、黑亮、無(wú)雜色孢子及氣生菌絲。 ②每批麩曲任取 1~2 瓶，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，將麩曲孢子接種于含 14%深度薯干粉的 500ml 三角瓶中，裝液量為 40ml，于轉(zhuǎn)速為 200r/min 的旋轉(zhuǎn)搖床上，35℃下培養(yǎng) 24h。下床測(cè)定費(fèi) （ 4）孢子懸浮液的制備： 將上述符合質(zhì)量要求的三角瓶麩曲，在無(wú)菌操 作下，每瓶加入 500~600ml 無(wú)菌水，搖勻，切勿將棉塞打濕，在火焰下并美工或并入接種罐中。 （ 5）發(fā)酵罐培養(yǎng) ①發(fā)酵培養(yǎng)基： 碳源：碳源除了合成細(xì)胞物質(zhì)和提供維持生命的能量外，主要用于合成代謝產(chǎn)物（檸檬酸）。從檸檬酸生產(chǎn)角度看，葡萄糖、蔗糖、糊清是良好的碳源，工業(yè)上為降低生產(chǎn)成本，多采用廉價(jià)的甘薯、玉米、小麥及其淀粉、糖蜜等。據(jù)報(bào)道，黑曲霉發(fā)酵中利用糖的有關(guān)酶系與糖濃度有關(guān)，糖深度低時(shí)，細(xì)胞內(nèi)這些酶就少，它們處于飽和狀態(tài)。關(guān)于碳源的最適濃度，目前都認(rèn)為高糖濃度是檸檬酸發(fā)酵的一大特征。我國(guó)采用玉米粉的深層發(fā) 酵，粉漿濃度為 16%~20%,若采用淀粉質(zhì)的深層發(fā)酵粉漿濃度可達(dá) 25%。 氮源：氮源的作用是合成細(xì)胞物質(zhì) (蛋白質(zhì)，氨基酸，核酸，維生素等 )和調(diào)節(jié)代謝，這是因?yàn)榧?xì)胞中銨離子濃度的升高，能解除 ATP 和檸檬酸對(duì)關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶的反饋抑制，使 EMP 代謝流量增強(qiáng)，有籃球檸檬酸生成與積累。經(jīng)試驗(yàn)證明，黑霉菌偏好于無(wú)機(jī)氮，當(dāng)有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮同時(shí)存在時(shí)，它首先利用無(wú)機(jī)氮。玉米培養(yǎng)基上 NH4NO3 是最好的氮源，在無(wú)機(jī)氮中，生理酸性氮比堿性氮好，這是因?yàn)樯硭嵝缘械匿@離子被利用后，使培養(yǎng)基變酸，可以使發(fā)酵中的黑曲霉生長(zhǎng)階段 結(jié)束，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸階段， pH 下降到較低水平有籃球檸檬酸的積累。所以銨鹽既可以調(diào)節(jié)代謝，也可以控制 pH。另?yè)?jù)報(bào)道，在檸檬酸發(fā)酵中途添加銨鹽，尤其是當(dāng)發(fā)酵中檸檬酸生成速率開(kāi)始下降時(shí)，添加銨離子最為有利，它對(duì)菌體無(wú)影響。這種效應(yīng)可能是銨離子對(duì)檸檬酸積累調(diào)節(jié)作用有關(guān)。 無(wú)機(jī)鹽：無(wú)機(jī)鹽是構(gòu)成微生物生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)，在檸檬酸發(fā)酵中，有的構(gòu)成菌體，有的促進(jìn)代謝，有的促進(jìn)產(chǎn)酸，因此對(duì)黑曲霉的生長(zhǎng)和檸檬酸發(fā)酵具有重要的作用。尤其對(duì)國(guó)外采用的不耐金屬離子的檸檬酸產(chǎn)生菌，在發(fā)酵中控制微量金屬離子水平是極為重要的。然而無(wú)機(jī)鹽對(duì)檸 檬酸發(fā)酵影響是十分復(fù)雜的， 它因菌種、原料、生產(chǎn)方式不同而不同。我國(guó)采用誘變方法改良的菌種能耐很高的金屬離子，因此原料和水不經(jīng)過(guò)任何處理就可用于發(fā)酵。 黑曲霉對(duì)無(wú)機(jī)鹽及微量元素的要求 要求 KH2PO4 含量 /% KCL 含量 MgSO4178。 7H2O 含量 /% Zn2+ 含量/(mg/L) Mn2+含量/((mg/L) Cu2+含量/((mg/L) S 含量/((mg/L) Fe2+含量/((mg/L) 深層發(fā)酵 ~ ~ ~ ＜ ＜ ＜ ＜ ＜ 2 ②發(fā)酵條件的控制 a 溫度： 黑曲霉發(fā)本地檸檬酸溫度控制在 28~30℃時(shí)，檸檬酸產(chǎn)率最高，發(fā)酵速度也最快，超過(guò) 35℃時(shí)，雖初期產(chǎn)酸較高，但最終產(chǎn)酸低于 15%以上。為了節(jié)約降溫能耗，我國(guó)在選育玉米發(fā)酵菌種時(shí)，有意地提高馴育溫度，故可在（ 37177。 1）℃的條件下發(fā)酵，但超過(guò) 42℃的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則影響發(fā)酵，且雜酸生成較多。在正常情況下發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵 24h 左右，草酸積累達(dá) %左右，隨著檸檬酸的積累， pH逐步下降，而草酸逐步被轉(zhuǎn)化，至發(fā)酵結(jié)束 時(shí)，總雜酸量為 5~7g/L。 b PH: 發(fā)酵的最短 Ph，分為起始和過(guò)程中的 pH，實(shí)驗(yàn)證明：發(fā)酵培養(yǎng)滅菌前將 pH 降到，滅菌后 pH為 時(shí)，發(fā)酵效果較好，低于此值效果下降。在玉米粉的檸檬酸發(fā)酵中，初始 pH 不加調(diào)節(jié)，為自然 pH，約為 。當(dāng)接入菌種后，菌種生長(zhǎng)繁殖，消耗氮源和銨離子，使培養(yǎng)基的 pH 下降，前期（ 12h） pH 下降較快，省略強(qiáng)的菌種培養(yǎng) 12h， pH可以降至 ~,24h 可以降至 ~。這時(shí)候會(huì)有少量的檸檬酸產(chǎn)生，但是由于發(fā)酵醪液固形物較多，原料成分繁雜，其中金屬離子含量較多， 緩沖作用大，再加上檸檬酸是三個(gè)羧基的有機(jī)酸。當(dāng)檸檬酸產(chǎn)量和殘?zhí)呛恐偷扔诨蚪咏鹗歼€原糖時(shí)，才提高通風(fēng)量，迅速進(jìn)入產(chǎn)酸期，使pH迅速降至 以下，保證檸檬酸發(fā)酵的正常進(jìn)行。 c 控制生物量： 正常的發(fā)酵液中生物量應(yīng)控制在 12~20g/L，過(guò)多的生物量會(huì)影響氧的溶解，增加發(fā)酵罐攪拌功率，且消耗了大量葡萄糖（一般認(rèn)為每增加 1g 生物量，要消耗1g以上的葡萄糖）。隨著培養(yǎng)液生物量的增加、溶氧也逐步降低，生物量的過(guò)度生長(zhǎng)，則檸檬酸的生成速率迅速下降。當(dāng)生物量過(guò)低，雖然溶氧較高，但檸檬酸的合成速度也較緩慢。以菌株體 形式生長(zhǎng)的菌體，可限制生物體大量繁殖。對(duì)溶氧的影響也較菌絲形式的菌體低。 d 嚴(yán)防缺氧： 檸檬酸發(fā)酵是典型的好氧發(fā)酵，對(duì)氧十分敏感。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)酸期只要有幾分鐘的缺氧時(shí)間，就會(huì)對(duì)發(fā)酵造成嚴(yán)重影響，甚至完全失敗。但生產(chǎn)中不可抗拒的意外事故，在所難免。遇到停電或因設(shè)備故障而造成通風(fēng)中斷時(shí)，要采取緊急措施 :關(guān)閉進(jìn)出空氣閥 。迅速啟動(dòng)備用電源恢復(fù)供氣；防止發(fā)酵罐中料液逆流到空氣過(guò)濾器中；用滅菌后的 CaCO3 或石灰乳中和發(fā)酵液 pH 至 ~，然后恢復(fù)正常操作。如事故發(fā)生在發(fā)酵液 pH＞ 時(shí)，恢復(fù)期較快，產(chǎn)酸稍 有影響，如發(fā)生在 pH小玉 時(shí)，恢復(fù)期會(huì)拖長(zhǎng)到 10 余小時(shí)，甚至難以恢復(fù)。 f 通風(fēng)量： 檸檬酸發(fā)酵通風(fēng)量相對(duì)來(lái)說(shuō)不大。通風(fēng)量不是一個(gè)固定值，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基的質(zhì)量、菌種生長(zhǎng)需要、發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)及其攪拌漿的型式和周線(xiàn)速度以及罐壓而定。一般規(guī)律是發(fā)酵罐容積越大、培養(yǎng)液層越厚、攪拌轉(zhuǎn)速越快則通風(fēng)量越小。通風(fēng)量過(guò)大菌體過(guò)早進(jìn)入衰亡期，也不利于 CO2 的固定，且動(dòng)力浪費(fèi)過(guò)多。氧的溶解與攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓成正比關(guān)系；與溫度和培養(yǎng)基粘度成反比關(guān)系。 三、檸檬酸發(fā)酵染菌的防治 檸檬酸發(fā)酵常見(jiàn)的污染菌：檸檬酸發(fā)酵初期，即發(fā)酵液 pH 時(shí)，常見(jiàn)的污染菌為細(xì)菌、酵母、曲霉及青霉菌等，隨著發(fā)酵液 pH 的下降，大多數(shù)細(xì)菌和曲霉被抑制或自溶，而耐酸性的酵母和青霉菌等繼續(xù)繁殖，重者導(dǎo)致發(fā)酵倒罐，輕者產(chǎn)酸很低且粘度增加，提取困難。 污染菌的檢查：大部分被污染的發(fā)酵液可以從發(fā)酵液的異常情況來(lái)檢出，如色度、異味，變稠或稀、生產(chǎn)菌球散開(kāi)、菌絲變形、產(chǎn)酸不正常甚至不產(chǎn)酸或“倒酸”、而糖卻大量消耗等。 防、治染菌措施：解決發(fā)酵工業(yè)的染菌問(wèn)題，不言而喻，應(yīng)以防為主。只有防得嚴(yán)才能消除或降低染菌因素。疏于防而重于治則必事倍而功半。 （ 1）防止染菌措 施： ①?lài)?yán)格無(wú)菌操作制度； ②加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理； ③重視設(shè)備管理，保持高的設(shè)備完好率； ④保證無(wú)菌空氣質(zhì)量； ⑤嚴(yán)格保證菌種質(zhì)量。 （ 2） 搶救染病措施： ①細(xì)菌污染醪的處理：發(fā)酵前期污染細(xì)菌，可加大通風(fēng)量，使發(fā)酵迅速轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸階段，當(dāng) pH下降至 以下時(shí)，細(xì)菌可被抑止或自溶死亡（含米曲霉菌）。 發(fā)現(xiàn)較遲，染菌較重，要立刻加檸檬酸母液或濃鹽酸、硫酸等而等將發(fā)酵液 pH 調(diào)節(jié)到＜ 再加風(fēng)量。如細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，本菌較少（某些細(xì)菌所產(chǎn)生的毒素能抑制或溶解黑曲霉菌體），則須將發(fā)酵液 pH 調(diào)節(jié)到 ~，重新按常規(guī)消毒。再一級(jí)接種，或與正常發(fā)酵罐（產(chǎn)酸＞ 6%）相互混合繼續(xù)發(fā)酵，但必須謹(jǐn)慎使用，防止“兩敗俱傷 ’ . ②酵母污染醪的處理：這是檸檬酸發(fā)酵最難處理的染菌事故，野生酵母即使在pH＜ 時(shí)，照樣生長(zhǎng)。 早期發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基稍有異味而總糖消耗不多，最好把 pH 下調(diào)至 ~后，間接加熱至 90℃重新滅菌，一級(jí)接種繼續(xù)發(fā)酵。如已產(chǎn)酸但不高，則加 CaCO3上調(diào) pH 至 ~，間接滅菌，重新一級(jí)接種發(fā)酵。后期污染酵母，如產(chǎn)酸已達(dá)到可提取程度，可提前加熱滅菌后放罐提到。如產(chǎn)酸不高但還原糖 尚有可繼續(xù)發(fā) 酵 的 量 時(shí) ， 可 采 取 提 高 培 養(yǎng) 溫 度 至 39~40 ℃ ， 加 大 風(fēng) 量 并 添 加~,即 50m3 發(fā)酵罐加 1~ 的硫酸銅抑止酵母生長(zhǎng)，加快產(chǎn)酸速度，減少損失。 ③污染曲霉及青霉的處理：如污染米曲霉，當(dāng) pH＜ 危害不大。如污染青霉則危害極大，這些雜菌能在低 pH 醪中生長(zhǎng)，結(jié)果使醪變稠、變黃、粘度增大，嚴(yán)重影響氧的傳遞， 導(dǎo)致發(fā)酵失敗，甚至“倒罐”。對(duì)付這種污染的措施：早期發(fā)現(xiàn)，可另補(bǔ)充一些新培養(yǎng)基，加 CaCO3 調(diào) pH至 ~， 重新滅 菌，一級(jí)接種發(fā)酵。 四、物料衡算： 缺失 設(shè)備選型 V— 發(fā)酵液體積 m3 G1— 設(shè)備身體的重量 kg C1— 設(shè)備身體的比熱容【 kj(m3*h)】 Q 最大 ={247。25+2545} 247。=58766kg/(m3*h) 發(fā)酵罐空罐滅菌蒸汽用量 （ 1）查表得 hb=40Mn,取 D:H=1:4 200=πD2[HD+2（ hb+D247。6） 247。4=13πD3247。12+ 解得： D= H= 橢圓封頭的體積： V=πD2（ hb+D247。6） 247。4= m3 封頭厚度： ξ=Pi247。(2[a]) =1000247。 (2105)=24mm 查表得，封頭重量為： 3128kg 內(nèi)壓圓筒厚度： δ=PDi247。(2[a]tP)+G1+G2 =3900247。(2105) = 取 24mm 查表得， 1m高筒節(jié)鋼板重量為： 發(fā)酵 罐罐體重量為： =36233kg 發(fā)酵罐重量為： 42597kg 列管換熱面積比為 1: h 列管 =200247。（ 108π247。1000） =708m