【文章內(nèi)容簡介】 〕 第五十頁，共一百一十一頁。 3． 炭粉吸附法 適用于苷類的精制工作。 植物的甲醇提取液加活性炭至吸附完全，過濾，得吸附苷的活性炭粉末。 依次用沸甲醇、沸水、 7%酚 /水、 15%酚 /醇洗脫，分步收集、檢查、合并。 大局部苷類可用 7%酚 /水洗下，經(jīng)減壓濃縮至小體積，乙醚除酚，余下水層經(jīng)減壓濃縮得較純黃酮苷。 第五十一頁，共一百一十一頁。 吸附原理 異黃酮、二氫黃酮〔醇〕 氯仿 甲醇不同比例 〔 105℃ ， 高度甲基化或乙?；S酮〔醇〕 混合溶劑洗脫 活化〕 〔極性小〕 〔加水失活或不活化〕 〔極性大〕 〔 80:20:1〕等比例 1．硅膠柱色譜 2．氧化鋁柱色譜〔少〕 具有 3OH或 5OH 、 4羰基及鄰二酚羥基黃酮類化合物與鋁離子絡(luò)和而被牢固吸附，難于洗脫。 三、別離 〔一〕柱色譜法 分配原理 多羥基黃酮醇或黃酮苷類 氯仿 甲醇 水 第五十二頁，共一百一十一頁。 (適用于別離醌、酚、黃酮 ) 原理：酰胺羰基與黃酮酚羥基形成氫鍵締合而吸附，吸附能力與酚羥基多少、位置及介質(zhì)有關(guān)。 —— 制備別離 洗脫劑：常用水 乙醇 水可洗下非黃酮的水溶性成分及少數(shù)黃酮 苷； 10%30%醇可洗下黃酮苷； 5095%乙醇可 洗下黃酮苷元 各種溶劑在聚酰胺柱上洗脫能力由 弱至強(qiáng) 依次為： 水，甲醇，丙酮，氫氧化鈉水溶液，甲酰胺，二甲基甲酰胺，脲素水溶液 第五十三頁，共一百一十一頁。 吸附規(guī)律： 〔 1〕酚羥基數(shù)目越多，吸附能力越強(qiáng)。 〔 2〕酚羥基數(shù)目相同的情況下，酚羥基所處的位置有利于形成分子內(nèi)氫鍵，吸附能力減弱。 3OH或 5OH黃酮的吸附力小于其他位置 OH黃酮； 鄰二酚羥基黃酮的吸附力弱于間位或?qū)ξ环恿u基黃酮 〔 3〕分子內(nèi)芳香化程度越高，共軛雙鍵越多，吸附力越強(qiáng)。 查耳酮 二氫黃酮 〔 4〕不同黃酮母核被吸附強(qiáng)弱：黃酮醇 黃酮 二氫黃酮醇 異黃酮 〔 5〕與介質(zhì)的關(guān)系：吸附力 水〔中〕 甲醇、乙醇〔濃度 由低到高〕 丙酮 堿性溶劑 甲酰胺 DMF 尿素水 洗脫規(guī)律：與吸附規(guī)律正好相反，即吸附能力越強(qiáng)，越難洗脫 第五十四頁，共一百一十一頁。 聚酰胺?雙重色譜〞原理 類似正相色譜 類似反相色譜 聚酰胺：極性固定相〔極性酰胺基團(tuán)〕 非極性固定相〔非極性脂肪鏈〕 洗脫劑：有機(jī)溶劑〔氯仿 甲醇，極性小〕 含水溶劑〔甲醇 水，極性大〕 先洗脫：苷元 苷 叁糖苷 雙糖苷 單糖苷 苷元 〔柱色譜別離〕 Rf值： 苷元 苷 苷元 苷 〔 TLC色譜鑒別〕 上述規(guī)律也適用于黃酮類化合物在聚酰胺薄層上的行為。 不符合氫鍵吸附規(guī)律 符合氫鍵吸附規(guī)律 第五十五頁，共一百一十一頁。 主要用兩種型號的凝膠 SephadexG型〔適用于水溶性成分別離〕 SephadexLH20型〔可用于親脂性成分別離〕 原理： 游離黃酮 —— 吸附作用 洗脫順序：極性小 大 。 黃酮苷類 —— 分子篩作用 洗脫順序：分子大 小。 總的洗脫順序： 糖多的苷 糖少的苷 游離苷元〔極性小 大〕 常用洗脫劑： ①堿水〔 〕，鹽水〔 NaCl〕 ②醇及含水醇 ③含水丙酮，甲醇－氯仿 第五十六頁，共一百一十一頁。 〔二〕 pH梯度萃取法 —— 利用酸性強(qiáng)弱 適合于酸性強(qiáng)弱不同的黃酮苷元的別離。 根據(jù)黃酮類苷元酚羥基數(shù)目及位置不同其酸性強(qiáng)弱也不同的性質(zhì)，將混合物溶于有機(jī)溶劑，依次用 ５％ NaHCO3,５％ Na2CO3, %NaOH, 4%NaOH萃取， 7,4’ 二羥基 7或 4’羥基 一般酚羥基 ５ 羥基黃酮 第五十七頁，共一百一十一頁。 〔三〕根據(jù)分子中某些特定官能團(tuán)進(jìn)行別離 〔 1〕醋酸鉛沉淀法 一般酚羥基的成分可被堿式醋酸鉛沉淀，但有鄰二酚羥基的成分可被醋酸鉛沉淀，據(jù)此可將兩類成分別離。 〔 2〕硼酸絡(luò)合法 根據(jù)具有鄰二酚羥基的黃酮與硼酸絡(luò)合，生成物易溶于水的性質(zhì)與其它類型黃酮別離。 通常在不與水混溶的有機(jī)溶劑如乙醚中，用硼酸液萃取，水相即為鄰二酚羥基類黃酮。 第五十八頁，共一百一十一頁。 第四節(jié) 黃酮類化合物的檢識與結(jié)構(gòu)測定 目前主要采用的方法有： ①色譜方法 與標(biāo)準(zhǔn)品或與文獻(xiàn)對照 PPC或 TLC得到的 Rf ②化學(xué)鑒別反響 顯色、鉛鹽沉淀 ③光譜方法 UV光譜：分析比照樣品在甲醇溶液中及參加酸、堿或金屬鹽類試劑后 UV光譜的變化 1HNMR、 13CNMR、 MS 第五十九頁，共一百一十一頁。 一、色譜法在黃酮類鑒定中的作用 (PPC) 2. 原理：分配原理 3. 適用范圍：黃酮苷元及苷的別離鑒別 ， ， 6. 第一相展開：醇性溶劑，如 BAW系統(tǒng)〔正丁醇： 醋酸：水 4： 1： 5〕 — 分配原理 7. 第二相展開：水性溶劑，如醋酸水 — 吸附原理 第六十頁，共一百一十一頁。 雙相色譜 第 I向 醇性展開劑 第 II向 水性展開劑 〔 BAW、 TBA、水飽和正丁醇〕 〔 2~6%HAc、 3%NaCl、 1%HCl〕 正相色譜 反相色譜 固定相〔水〕極性 流動相 Rf規(guī)律：極性小的化合物 Rf大 極性大的化合物 Rf大 苷元〔 〕 單糖苷 雙糖苷〔 〕 苷元中，平面型分子 非平面型分子 Rf規(guī)律與左邊相反 母核相同，一 OH二 OH三 OH四 OH五 OH黃酮 苷元的別離鑒別 黃酮苷及花色素類 第六十一頁，共一百一十一頁。 2. 薄層層析 (TLC) １〕硅膠薄層 用于弱極性黃酮。 ２〕聚酰胺層析 適用范圍廣，可別離含游離酚羥基或其苷類。 各種色譜的檢識： 日光下觀察 — 多數(shù)黃酮有黃色斑點(diǎn) 紫外光下觀察 — 多數(shù)黃酮呈黃綠色熒光斑點(diǎn) 氨蒸氣熏 — 多數(shù)黃酮有顏色變化 噴顯色劑〔 2%AlCl3甲醇液〕 — 多數(shù)黃酮黃色變 深，熒光加強(qiáng) 第六十二頁，共一百一十一頁。 二、紫外光譜在黃酮類鑒定中的應(yīng)用 可用于確定黃酮母核類型及確定某些位置是否含有羥基。 一般程序： ①測定樣品在甲醇中的 UV譜以了解母核類型； ②在甲醇溶液中分別參加各種診斷試劑后測 UV譜以了解 3,5,7,3’ ,4’有無羥基及鄰二酚羥基； 常用的診斷試劑有甲醇鈉〔 NaOMe〕、醋酸鈉〔 NaOAc〕、醋酸鈉 /硼酸〔 NaOAc/H3BO3〕、三氯化鋁〔 AlCl3〕及三氯化鋁 /鹽酸〔 AlCl3/HCl〕等 ③苷類可水解后〔或先甲基化再水解〕，再用上法測苷元的 UV譜以了解糖的連接位置。 第六十三頁，共一百一十一頁。 〔一〕在甲醇溶液中的紫外光譜 多數(shù)黃酮類化合物由兩個主要吸收帶組成： 帶 Ⅰ 〔 300400nm〕 —— 由 B環(huán)桂皮酰基系統(tǒng)引起，主要反響 B環(huán)取代情況； 帶 Ⅱ 〔 220280 nm〕 —— 由 A環(huán)苯甲?；到y(tǒng)引起，主要反響 A環(huán)取代情況 ABOOOOR－OOR－峰 帶 Ⅱ , 2 2 0 ~ 2 8 0 n m 峰 帶 Ⅰ , 3 0 0 ~ 4 0 0 n mB 環(huán) 桂 皮 酰 系 統(tǒng)A 環(huán) 苯 甲 酰 系 統(tǒng)第六十四頁，共一百一十一頁。 〔 1〕黃酮、黃酮醇： 在 200400 nm之間出現(xiàn)兩個主要吸收峰，二者峰形相似，但帶 Ⅰ 位置不同，可據(jù)此進(jìn)行分類。 母核上如 7及 4‘位引入羥基、甲氧基等供電基取代 —— 相應(yīng)吸收帶紅移 通常整個母核上氧取代程度越高，帶 Ⅰ 越向長波方向位移。 帶 Ⅱ 的峰位主要受 A環(huán)氧取代程度的影響，但 B環(huán)的取代基可影響它的形狀。當(dāng) B環(huán)有 3‘， 4‘ 二氧取代時，帶 Ⅱ 將為雙峰。 第六十五頁，共一百一十一頁。 〔 2〕查耳酮及橙酮類： 共同特征是帶 Ⅰ 強(qiáng)，為主峰；帶 Ⅱ 較弱，為次強(qiáng)峰。 查耳酮：帶 Ⅱ 位于 220～ 270 nm； 帶 Ⅰ 位于 340～ 390 nm； 橙酮：常顯現(xiàn) 3～ 4個吸收峰，但主要吸收峰一般位 于 370～ 430 nm。 〔 3〕異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇 有由 A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)引起的帶 Ⅱ 吸收 但因 B環(huán)不與吡喃酮環(huán)上的羰基共軛〔或共軛很弱〕，故帶 Ⅰ 很弱。 OOBOORAB二氫黃酮〔醇〕 異黃酮 第六十六頁，共一百一十一頁。 帶 II(240285nm)（苯甲酰系統(tǒng)） 帶 I(300400nm) 桂皮酰系統(tǒng) 類 型 說 明 250285 304350 黃酮類 OH越多，帶 I、 II越紅移；B環(huán) 3’,4’有 OH基，帶 II為雙峰（主峰伴肩峰） 328357 黃酮醇類 (3OR) 352385 黃酮醇類 (3OH) 245270 異黃酮 B環(huán)上有 OH, OCH3對帶 I影響不大 270295 二氫黃酮（醇） 220270(較弱 ) 340390 或 340390(Ia)和 300320(Ib) 查耳酮類 查耳酮 2’或 4OH使帶 I紅移 370430(34個小峰 ) 橙酮類 第六十七頁，共一百一十一頁。 第六十八頁，共一百一十一頁。 2．參加診斷試劑后引起的位移及結(jié)構(gòu)測定 P191 表 5－ 11 第六十九頁，共一百一十一頁。 診斷試劑 帶 II 帶 I 說明 樣品+MeOH 250285 304385 兩峰強(qiáng)度基本相同，具體位置與母核上電負(fù)性取代