【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 現(xiàn)。在高溫季節(jié)，培養(yǎng)基滅菌后，待鍋內(nèi)溫度降至 50℃ 時(shí)，取出大試管， 將 大 試管頭部枕在 小 木條上，使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜， 斜面長(zhǎng)度為試管長(zhǎng)度的 ?， 覆蓋保溫物讓其自然緩慢冷卻， 凝固后即成斜面培養(yǎng)基。 ? 斜面無(wú)菌檢驗(yàn) 將滅菌后的斜面放置 28℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 3d，剔除被污染的斜面 。 富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 5 菌絲體 轉(zhuǎn)管 ① 材料準(zhǔn)備 接種鉤、 棉球、 鑷子、 75%酒 精 棉 球 、 75%酒精、金針菇母種培養(yǎng)基、 酒精燈 ② 超凈工作臺(tái)的滅菌 在接種前，取 75%酒 精 棉球 蘸上 75%酒精將超凈工作臺(tái)表面 消毒，將待接種的斜面培養(yǎng)基放入超凈臺(tái)內(nèi)，并開啟紫外線燈滅菌 30min。 ③ 取 75%酒 精 棉 球 蘸上 75%酒精擦拭雙手、超凈臺(tái)的工作臺(tái)面、接種工具、金針菇母種試管的表面。 ④ 菌絲體的轉(zhuǎn)管 點(diǎn)燃酒精燈開始接種操作。接種操作需靠近火焰，但注意不要灼傷菌種。將所要母種和斜面培養(yǎng)基用大拇指和其他四指并排握住，斜面向上，并使試管位于水平位置。右手輕輕松動(dòng)棉塞，以利于接種時(shí)能較容易的拔出。右手拿接種鉤，在裝有酒精的瓶子中蘸一下，然后在火焰上燒紅，進(jìn)行灼燒滅菌。用右手小指和無(wú)名指拔掉棉塞。在火焰上灼燒試管口，灼燒時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng) 試管，將其沾上的少量雜均燒死。將灼燒過的接種鉤伸入母種試管內(nèi)，放在試管內(nèi)壁停留片刻使之冷卻以免燙傷菌種。 在菌絲濃密處， 取出 178。大小的菌種塊，迅速抽出，不要碰到管壁。迅速通過酒精燈火焰無(wú)菌區(qū)，把菌種塊送入斜面培養(yǎng)基的中央。灼燒試管口，并將棉塞在火焰上迅速過一下，塞上。將接種鉤在火焰上灼燒至紅，放回超凈臺(tái)。將接好的試管貼上標(biāo)簽，注明菌種名稱和接種時(shí)間，放在25℃培養(yǎng) 9d 長(zhǎng)滿斜面。 紫外誘變 ① 材料準(zhǔn)備 報(bào)紙 、棉球、 75%酒精、 75%酒精 棉球 ② 儀器準(zhǔn)備 培養(yǎng)皿、 酒精燈、 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 、電 爐 ③ 培養(yǎng)皿 干熱滅菌 取培養(yǎng)皿 12套，洗凈后晾干。取 6套培養(yǎng)皿，使用報(bào)紙包扎 起來。另外 6套的處理方法與此相同。將上述 12 套培養(yǎng)皿 放入 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 滅菌， 將其溫度設(shè)置為 130℃，時(shí)間設(shè)置為 4h。 ④ 超凈 臺(tái)的滅菌 取 75%酒精棉球 蘸 上 75%酒精將超凈工作臺(tái)表面消毒，并開啟紫外線燈滅菌 30min。 ⑤ 融化培養(yǎng)基 將 裝滿水的鍋放置電爐上，插上電源，加熱。內(nèi)部裝有綜合馬鈴薯培養(yǎng)基的錐形瓶放置在鍋內(nèi)，水浴加熱。培養(yǎng)基完全融化后取出，放置在超凈臺(tái)上。 ⑥ 倒平板 取酒精棉球，蘸上酒精后，擦拭錐形瓶表面。趁熱倒平板， 培養(yǎng) 皿的握法 如下： 將已滅菌的培養(yǎng)皿放置在超凈臺(tái)上。點(diǎn)燃酒精燈。 右手 小拇指和無(wú)名指拖住培養(yǎng)皿的底部，大拇指和中指卡在培養(yǎng)皿的側(cè)面，食指扣在培養(yǎng)皿的上部。在酒精燈火焰的無(wú)菌區(qū)，將錐形瓶中的培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，厚度以培養(yǎng)基能覆蓋培養(yǎng)皿底部即可。 富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 6 ⑦ 平板無(wú)菌檢驗(yàn) 將平板放置 28℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 3d，剔除被污染的平板。 ⑧ 超凈臺(tái) 的滅菌 ⑨ 接種 點(diǎn)燃酒精燈，將復(fù)壯后的白色金針菇和金針菇 201，使用接種鉤， 在菌絲濃白粗壯處 取出 178。大小的菌種塊 。在火焰無(wú)菌區(qū)，左手拿培養(yǎng)皿，將菌種塊轉(zhuǎn)接至平板上。 ⑩ 菌絲體紫外誘變 將超 凈臺(tái)面清理干凈，使用酒精棉球蘸上酒精，擦拭超凈臺(tái)面。揭開培養(yǎng)皿的蓋子，開啟紫外燈，直接照射菌種塊上的菌絲體，進(jìn)行紫外誘變，一批照射 5min，一批照射 10min。 ? 恒溫箱培養(yǎng) 紫外誘變后，將平板放置 電熱恒溫培養(yǎng)箱 中培養(yǎng) 9d。 菌絲體的活化與復(fù)壯 ① 將 中獲得的金針菇 201 和白色金針菇菌絲體，繼續(xù)轉(zhuǎn)管 2次，每次培養(yǎng) 9d。 ② 將 中獲得的誘變體 、 、白 .白 .10 轉(zhuǎn)管 2 次，每次培養(yǎng)9d，使其活化。 ③ 每次轉(zhuǎn)管都應(yīng)在菌絲濃白粗壯處挑取菌種塊。 菌種 保藏 菌種保藏的目的就是使菌種在較長(zhǎng)期的保藏之后，不被雜菌污染，仍能保持原有的生活力和生產(chǎn)性能，其形態(tài)特征、理化特性和遺傳性狀不會(huì)發(fā)生改變。穩(wěn)定的保藏保證了優(yōu)良菌株的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，也可以作為分離菌株的對(duì)照和驗(yàn)證研究結(jié)果。 菌種保藏的 原理就是通過降低營(yíng)養(yǎng)、 缺氧 、干燥、低溫等手段，降低菌株的新陳代謝， 使菌種暫時(shí)處于休眠狀態(tài)， 抑制菌絲的生長(zhǎng)和繁殖，從而降低其變異率。 菌種保藏的方法有多種，斜面低溫 保藏法、 液體石蠟保藏法、半固體穿刺保藏法、沙土管保藏法、加入保護(hù)劑凍存保藏法、冷凍真空干燥保藏法等 [11]。 我們采用斜面低 溫保藏法，具體方法是將金針菇菌種接種于馬鈴薯 綜合 培養(yǎng)基中，25℃ 條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中要勤檢查 ,當(dāng)菌絲 體 長(zhǎng)滿斜面 ，及時(shí)挑選無(wú)污染、菌絲濃白粗壯的固化菌種 ,放在 4℃冰箱中保藏 ,每隔 3 個(gè)月時(shí)間移植轉(zhuǎn)管一次。保藏時(shí) 棉塞部分 需用滅過菌 的牛皮紙包扎棉塞 ,以防 培養(yǎng)基干燥 ，也可降低 污染的機(jī)會(huì)。 固化 富硒 培養(yǎng) 本次實(shí)驗(yàn)，我 將培養(yǎng)基富硒濃度梯度設(shè)置為 0、 1 2 340(μg/L)[12]。 ① 配置 固化 CM 培養(yǎng)基 取 9個(gè)錐形瓶編號(hào)。向 9個(gè)錐形瓶中各加入硒儲(chǔ)備液 0、富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 7 8mL。配置固化 CM 培養(yǎng)基，分裝至錐形瓶中， 200mL/個(gè)，搖勻，獲得各個(gè)硒濃度梯度的固化 富硒 CM 培養(yǎng)基 母液 。 ② 滅菌 錐形瓶用 8 層紗布、牛皮紙包扎后，放入滅菌鍋中滅菌。溫度設(shè)置為115℃ ，時(shí)間為 30min。打開超凈臺(tái)上的紫外燈，滅菌 30min。 ③ 倒平板 在超凈臺(tái)滅菌后，取已滅菌的培養(yǎng)皿 54 套。取出錐形瓶，將 200mL富硒 CM 培養(yǎng)基 母液 分裝至 6 套培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿貼上標(biāo)簽。白 . 中的“ 0”代表培養(yǎng)基含硒量為“ 0”，其他以此類推。 ④ 平板無(wú)菌檢驗(yàn) 將已滅菌的斜面置于 25℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 3d，只有培養(yǎng)基表面及基質(zhì)內(nèi)無(wú)任何雜菌菌落出現(xiàn)，說明已達(dá)到滅菌目的，才可使用。 ⑤ 接種 將金針菇母種接種至富硒培養(yǎng)基，其中母種設(shè)置為 田野金針菇 20野樹林白色金針菇 ，誘變梯度設(shè)置為 10min，硒濃度梯度為 0、 1 2 3 40（ μg/L）。設(shè)置一不接種的、不含硒的空白對(duì)照。 ⑥ 富硒培養(yǎng) 將平板置于 電熱恒溫培養(yǎng)箱 25℃ ，培養(yǎng) 9d。 液體富硒培養(yǎng) 我們將培養(yǎng)基富硒濃度梯度設(shè)置為 0、 1 2 40（ μg/L）。 ① 配置液體 富硒 CM 培養(yǎng)基 取 8個(gè)錐形瓶編號(hào)。向 8 個(gè) 大 燒杯 中各加入硒儲(chǔ)備液 0、 1 1 1 24mL。配置 液體 CM培養(yǎng)基， 向各個(gè)燒杯中加入液體 CM 培養(yǎng)基 600mL，搖勻，獲得各個(gè)硒濃度梯度的 液體 富硒 CM 培養(yǎng)基 母液 。 ② 分裝 取干凈的錐形瓶 48套。將 每個(gè) 600mL 富硒 CM 培養(yǎng)基 母液 分裝至 6 個(gè)錐形瓶 中， 貼上標(biāo)簽。 ③ pH 測(cè)定 使用 數(shù)字式 pH 計(jì) 測(cè)定錐形瓶中的 pH， pH 自然即可。 ④ 培養(yǎng)基、超凈臺(tái)的滅菌 ⑤ 液體富硒培養(yǎng)基的無(wú)菌檢驗(yàn) 與斜面無(wú)菌檢驗(yàn)方法一致，在 25℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 3d 后，只有當(dāng)發(fā)酵液依然保持原來的清 澈程度，才可使用。 ⑥ 接種 將金針菇母種接種至富硒培養(yǎng)基，其中母種設(shè)置為 田野金針菇 20野樹林白色金針菇 ，誘變梯度設(shè)置為 10min，硒濃度梯度為 0、 1 2 3 40（ μg/L）。設(shè)置一不接種的、不含硒的空白對(duì)照。 ⑦ 富硒培養(yǎng) 將平板置于 全溫培養(yǎng)搖床 ，溫度設(shè)置為 25℃ ， 250r/min， 培養(yǎng) 9d。 固化 金針菇菌絲的形態(tài)學(xué)檢測(cè) ① 測(cè)定菌絲 粗細(xì)、 疏密 程度 、色澤 。 ② 測(cè)定 菌落 半徑 利用 十字交叉法 ，用游標(biāo)卡尺測(cè)定 菌 落 生長(zhǎng) 直徑。 計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速率 。 ③ 測(cè)定菌 絲直徑 [13] 使用鏡臺(tái)測(cè)微尺將顯微鏡的目鏡測(cè)微尺校準(zhǔn)。在載玻片上滴一滴乳酸 石炭酸 棉藍(lán)染色液，用鑷子取出菌絲，放置在染色液中，使用 40 倍富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 8 目鏡測(cè)定其直徑。 ④ 測(cè)干重 使用鑷子 盡量將培養(yǎng)基上的菌絲挑取出來，并且不可沾上培養(yǎng)基。收集菌絲體于稱量瓶，在電熱恒溫干燥箱（溫度設(shè)置為 60℃ ）中烘干至恒重，用 電子分析天平 稱其干重。 液體培養(yǎng) 金針菇菌絲 球 的形態(tài)學(xué)檢測(cè) ① 觀察菌絲球的色、香、味 、 測(cè)定菌液 pH、 測(cè)菌絲球數(shù)目 [14]。 ② 測(cè)菌絲球直徑 將液體富硒培養(yǎng)所獲得的金針菇菌絲球 及其培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中 。在大大小小的菌絲球中，選擇其中較大的 3個(gè)和較小的 3 個(gè)，使用游標(biāo)卡尺測(cè)定這 6個(gè)菌絲球的直徑，從而得出該培養(yǎng)基菌絲球的直徑范圍。 ③ 測(cè)干重 使用 2 層紗布過濾液體富硒培養(yǎng)基中的菌絲球，置于 培養(yǎng)皿 ，加入蒸餾水充分洗滌，過濾。如此反復(fù) 5 次。 收集菌絲球于稱量瓶，在電熱恒溫干燥箱（溫度設(shè)置為 60℃ ）中烘干至恒重， 用電子分析天平 稱其干重。 ④ 計(jì)算菌絲體生物量 菌絲體生物量是菌絲體干重 （ g） 與液體培養(yǎng)基體積 （ mL）的比值 [15]。 紫外分光光度法測(cè)定金針菇菌絲體中的含硒量 在參考文獻(xiàn)地基礎(chǔ)上 [16]， 我們做了改進(jìn) ： 明確了硫酸高氯酸消化時(shí)間和水浴鍋加熱反應(yīng)時(shí)間， 我們通過在通風(fēng)處操作以及將錐形瓶蓋上塞子，防止具有刺激性氣味的白霧進(jìn)入空氣，危害身體健康， 將其中激烈反應(yīng)這一并不明顯的特征表現(xiàn)刪除， 將冒白煙這一特征改成冒白霧，其出現(xiàn)的時(shí)間我們按照實(shí)驗(yàn)事實(shí)做了更正， 使用 100℃ 水浴鍋代替電沙浴達(dá)到節(jié)能效果， 菌絲體與子實(shí)體不同，我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)，將文獻(xiàn)中加分析純 改為 ， 明確提醒出可能會(huì)出現(xiàn)問題的地方，防止操作不慎產(chǎn)生惡果， 提醒使用塑料瓶盛裝濃 NaOH 溶液， 硫酸高 氯酸消解液配置好后應(yīng)避光保存 ， 因 EDTA溶解度較低，實(shí)驗(yàn)中使用 EDTA 二鈉鹽代替 EDTA。 ① 消化 使用電子分析天平稱取金針菇菌絲粉末 （平板獲得的菌絲體?。?， 置于 250mL 錐形瓶中，使用移液管加入硫酸高氯酸消解液 12ml，塞上橡膠塞。在室溫下放置 24h，瓶中菌絲粉末被消化成糊狀。 ② 提硒 打開水浴鍋，溫度設(shè)定為 100℃ 。在通風(fēng)處，向錐形瓶中加入鉬酸鈉溶液 3ml，可看到冒出白霧，鉬酸鈉加入完畢后迅速將塞子塞上，防止白霧擴(kuò)散至空氣中。輕輕地水平地?fù)u勻 1min，以防粉末顆 粒粘到了錐形瓶的側(cè)壁，導(dǎo)致消化不完全。然后將其放置在水浴鍋中加熱，瓶中產(chǎn)生大量翻滾的白霧。加熱1h 后，即溶液由糊狀變成淡黃色時(shí)，取出錐形瓶置于臺(tái)面上冷卻。向溶液中加入蒸餾水 35mL。在通風(fēng)處，加入分析純 ，此 NaOH 固體應(yīng)少量多次加入，每次加入后搖勻，使其完全溶解，防止溶液爆沸。反應(yīng)放熱并有刺激性氣體富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 9 使用 8mol/LNaOH 溶液和 pH 計(jì)調(diào)混合溶液 pH 為中性。依次加入 40%鹽酸羥胺溶液 2mL、 、 1:1(V/V)磷酸溶液 2mL,加塞搖勻 1min。 ③ 萃取 向 溶液加入 %鄰苯二胺溶液 2mL,搖勻后靜置 2h。開啟紫外分光光度計(jì)預(yù)熱，設(shè)置波長(zhǎng)為 335nm。將錐形瓶移至紫外分光光度計(jì)旁的通風(fēng)處 ,使用移液管加入甲苯 10mL,振蕩 1min,將混合液倒入大試管 （ 70mL） 中 ,將大試管放入試管架上，靜置 10min。 ⑤ 測(cè)定 取上層甲苯于石英比色皿中，測(cè) 吸收 值。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別 取硒 標(biāo)準(zhǔn)液 0， ， ， ， ， ， 于 250 mL錐形瓶中 ，相當(dāng)于分別含硒 0， 6， 12， 18， 24， 30μg/mL， 經(jīng)過消化、提硒、萃取、測(cè)定步驟后，獲 得其在 335nm處的 吸收 值 。 以硒含量為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)繪圖。以吸收值 A對(duì)硒含量回歸，獲得回歸方程。 富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 10 3 結(jié)果與分析 （討論） 紫外誘變對(duì)金針菇形態(tài)學(xué)特征的影響 紫外誘變 實(shí)驗(yàn)中 ，選擇金針菇 201 和白色金針菇兩個(gè)菌種。我設(shè)置了 0、 10min 中的時(shí)間梯度，隨后在平板中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)紫外誘變時(shí)間越長(zhǎng)，菌絲體的生長(zhǎng)速率明顯下降，并且菌絲越顯得瘦弱。 金針菇在液體富硒培養(yǎng)中的特性 針對(duì)菌絲培養(yǎng)后硒含量的測(cè)定，我使用石英比色皿和玻璃比色皿制作了兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)表格及曲線圖見表 1~2 和圖 1~2。 實(shí) 驗(yàn)中，針對(duì)金針菇 20白色金針菇及其紫外誘變菌種進(jìn)行了條件優(yōu)化的液體富硒培養(yǎng)，使金針菇菌絲體在液體培養(yǎng)基中能夠充分的接觸到培養(yǎng)基。在液體富硒培養(yǎng)中，可以得出金針菇菌絲體各個(gè)菌株的不同特性。 觀察 發(fā)酵液的濁度，菌絲球的色、香、味 及其形狀 ，測(cè)定菌液 pH 和菌絲球直徑，測(cè)菌絲球數(shù)目及其干重 ，記錄各個(gè)菌種各個(gè)梯度菌絲球干燥所需的時(shí)間 。 通 過對(duì)上述菌 株的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行了