【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 藥的用量，維護(hù)生態(tài)平衡，降低防治成本，減少環(huán)境污染，有利于可持續(xù)發(fā)展。就病原來(lái)說(shuō)，昆蟲對(duì)真菌易被感染，因?yàn)檎婢峭ㄟ^(guò)孢子產(chǎn)生芽管而直接穿透體壁進(jìn)行感染的，而其它微生物如病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物主要是經(jīng)口傳染。綠僵菌對(duì)寄主的入侵是寄主與病原菌之間的生理生化作用的綜合結(jié)果，可通過(guò)體壁、氣門、消化道等多種途徑侵染宿主，其中體壁途徑是主要方式。綠 僵 菌 制 劑 屬 于 活 體 類 微 生 物 ， 其 防 效 在 很 大 程 度 上 受 到 外 界 環(huán) 境 條 件 的 制 約 ，尤 其 是 溫 度 、 濕 度 和 紫 外 線 的 影 響 ， 為 了 解 決 這 一 難 題 ， 必 須 依 賴 劑 型 的 開 發(fā) 和改 進(jìn) ， 添 加 促 進(jìn) 孢 子 在 低 溫 、 低 濕 條 件 下 萌 發(fā) 的 助 劑 和 紫 外 保 護(hù) 劑 。 中 國(guó) 研 究 開發(fā) 綠 僵 菌 起 步 晚 ， 經(jīng) 過(guò) 多 年 的 研 究 開 發(fā) 在 菌 株 選 育 、 生 產(chǎn) 工 藝 、 劑 型 和 防 治 對(duì) 象 上已 有 長(zhǎng) 足 進(jìn) 步 。 目 前 ， 重 慶 大 學(xué) 基 因 研 究 中 心 完 成 了 殺 蝗 綠 僵 菌 生 物 農(nóng) 藥 的 研 制 ，取 得 了 重 要 的 研 究 成 果 ， 生 產(chǎn) 的 產(chǎn) 品 已 在 國(guó) 內(nèi) 多 個(gè) 省 份 示 范 試 驗(yàn) 。 與傳統(tǒng)的化學(xué)藥物不同，綠僵菌復(fù)合劑用蟲生真菌消滅白蟻、蝗蟲等害蟲。田間大規(guī)模應(yīng)用試驗(yàn)的結(jié)果顯示，綠僵菌能適用于室內(nèi)外，在防治桉樹白蟻方面具有用量少、成本低，保證苗木成活率 95％以上的特點(diǎn)。據(jù)悉，目前綠僵菌滅白蟻、蝗蟲的方法已經(jīng)作為國(guó)家重點(diǎn)推廣應(yīng)用項(xiàng)目，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)田、林木、橋梁等多個(gè)領(lǐng)域的防治工作。每株桉樹增加 2 分錢的成本，就能使 95％以上的桉樹逃脫白蟻的摧殘。 利用綠僵菌防治害蟲的方法很多，如它可支撐粉劑或液劑進(jìn)行大面積田間撒布，也可拌種或混入肥料內(nèi)，或制成顆粒劑施用防治害蟲。在綠僵菌劑中加入少量化學(xué)農(nóng)藥，有增效作用?？梢苑乐嗡擅x，玉米螟，稻葉蟬和稻飛虱，大豆食心蟲等。嘧霉胺(pyrimet hanil) 是近幾年出現(xiàn)的新一代嘧啶胺類殺菌劑，20 世紀(jì) 90 年代初，嘧霉胺率先在歐洲大面積推廣，1998 年嘧霉胺在我國(guó)首次獲得農(nóng)藥登記。具有保護(hù)、葉片穿透及根部?jī)?nèi)吸活性，對(duì)葡萄、草莓、番茄、洋蔥、豌豆、黃瓜、茄子、果樹的病害有優(yōu)劃的預(yù)防、治療特別是鏟除效果。嘧霉胺作用位點(diǎn)單一，屬高抗藥性風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑，它的作用機(jī)理獨(dú)特，即抑制病原菌蛋白質(zhì)分泌，降低某些水解酶水平，而這些水解酶與病原菌引起寄生組織壞死有關(guān)。嘧霉胺同現(xiàn)在應(yīng)用的三唑類、二硫代甲酸酯類，苯并味唑類及乙霉威類殺菌劑，無(wú)交互抗性，因而對(duì)抗性病原菌或敏感病菌均有效。嘧霉胺使用較多的沈陽(yáng)市、遼陽(yáng)市、大連市和鞍山市抗藥性頻率較高。在離體條件下，抗藥性菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性及與敏感菌株相似的適應(yīng)性，這意味著抗藥性菌株沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文3在田間具有較高的適合度 ，如果嘧霉胺長(zhǎng)期、連續(xù)使用將導(dǎo)致抗藥性菌株比例上升，防治失敗。嘧啶胺類殺菌劑嘧菌環(huán)胺目前尚未在遼寧省大面積推廣使用，從其與同類殺菌劑嘧霉胺之間存在正交互抗性結(jié)果看出。因此，為延緩其抗性產(chǎn)生 ，建議與不同作用機(jī)制的殺菌劑輪換使用，制定合理的用藥次數(shù)與頻率。年已有多篇關(guān)于對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道。甚至出現(xiàn)了高抗藥性菌株。嘧霉胺在遼寧省目近前仍是防治中的有效藥劑。但許多農(nóng)民習(xí)慣于連年使用同種殺菌劑，且一季噴灑多次，這給病原菌產(chǎn)生抗藥性創(chuàng)造了極為有利的條件，為延長(zhǎng)嘧霉胺的使用壽命，避免因產(chǎn)生嚴(yán)重抗性給生產(chǎn)造成重大損失，建議根據(jù)不同地區(qū)的抗藥性水平積極采取相應(yīng)措施，如推廣綜合防治技術(shù)、減少每季用藥次數(shù)、與不同作用機(jī)制的殺菌劑復(fù)配或交替使用等。目前，嘧霉胺在遼寧省及全國(guó)范圍對(duì)作物的防治中使用范圍比較廣。許多農(nóng)民習(xí)慣于連年使用同種殺菌劑，且一季噴灑多次，這給病原菌產(chǎn)生抗藥性創(chuàng)造了極為有利的條件，為延長(zhǎng)嘧霉胺的使用壽命，避免因產(chǎn)生嚴(yán)重抗性給生產(chǎn)造成重大損失，建議根據(jù)不同地區(qū)的抗藥性水平積極采取相應(yīng)措施，如推廣綜合防治技術(shù)、減少每季用藥次數(shù)、與不同作用機(jī)制的殺菌劑復(fù)配或交替使用等。在生產(chǎn)中注意IPM即對(duì)病害的綜合防治，采用生態(tài)防治等多種方法減輕病害壓力。在嘧霉胺的使用過(guò)程中，要合理用藥避免任意減小嘧霉胺的使用倍數(shù)，增大藥劑的選擇壓力；同時(shí)避免長(zhǎng)期使用嘧霉胺，減少同一生長(zhǎng)季的用藥次數(shù)。將不同作用機(jī)制的殺菌劑復(fù)配或交替使用，在復(fù)配或交替使用時(shí)可以使用與嘧霉胺無(wú)交互抗性的藥劑：多菌靈或者腐霉利，避免使用有正交互抗性的嘧菌環(huán)胺。同時(shí)加強(qiáng)田間抗藥性的檢測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，及時(shí)采取相應(yīng)措施。本試驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)化學(xué)藥劑誘導(dǎo)，初步獲得了對(duì)嘧霉胺的抗性菌株，研究了抗藥性菌株的生物學(xué)性狀，評(píng)估其抗藥性，以期為嘧霉胺的合理推廣應(yīng)用提供依據(jù)。綠僵菌抗藥性菌株的馴化選育41 材料與方法 材料　供試病原菌綠僵菌(M etarhizium anisopliae (Metschn.) Sor. )，由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供。　供試藥劑 20% 嘧霉胺懸浮劑，吸取 1ml 20%嘧霉胺懸浮劑，用無(wú)菌水稀釋至 10ml，配制成 20220181。gmL1 母液，供本試驗(yàn)使用。 供試培養(yǎng)基PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯（煮汁）200g，葡萄糖 20g，瓊脂 20g，1000 毫升水。將馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水煮沸半小時(shí)，用雙層紗布過(guò)濾薯塊，補(bǔ)足水量，加入瓊脂，加熱溶化，再加糖，待完全化后，乘熱用雙層紗布過(guò)濾到 1000ml 的塑料燒杯中，乘熱分裝到三角瓶中，每瓶裝量不超過(guò)三角瓶容量的 2/3，塞好棉塞，121℃高壓濕熱滅菌25min。培 養(yǎng) 基 經(jīng) 滅 菌 后 ， 必 須 放 在 37C 溫 箱 培 養(yǎng) 24h， 無(wú) 菌 生 長(zhǎng) 者 方 可 使 用 。PDA 培 養(yǎng) 基 一 般 不 需 要 調(diào) pH。 對(duì) 于 要 調(diào) 節(jié) pH 的 培 養(yǎng) 基 ， 一 般 用 pH 試 紙 測(cè) 定 其pH。 如 果 培 養(yǎng) 基 偏 酸 或 偏 堿 時(shí) ， 可 用 lmol／ LNaOH 或 lmol／ LHCL 溶 液 進(jìn) 行 調(diào)節(jié) 。 調(diào) 節(jié) 時(shí) 應(yīng) 逐 滴 加 入 NaOH 或 HCl 溶 液 ， 防 止 局 部 過(guò) 酸 或 過(guò) 堿 破 壞 培 養(yǎng) 基 成 分 。培 養(yǎng) 基 在 使 用 時(shí) 也 可 以 做 成 不 含 瓊 脂 的 液 體 培 養(yǎng) 基 ， 用 于 菌 類 的 震 蕩 培 養(yǎng) 。 培 養(yǎng)基 也 可 以 加 入 氯 霉 素 或 土 霉 素 ， 加 入 量 為 ， 主 要 是 為 了 抑 制 細(xì) 菌 的生 長(zhǎng) ， 減 少 干 擾 性 。 儀器及用品移液槍、培養(yǎng)皿、膠頭滴管、試管架、玻璃棒、孢子測(cè)微器、酒精燈、試管、移植針、漏斗、凹玻片、紗布、濾紙、250ml 三角瓶、顯微鏡、計(jì)數(shù)器、恒溫箱、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱 試驗(yàn)方法 綠僵菌對(duì)嘧霉胺抗藥性菌株的誘導(dǎo)將綠僵菌菌株接種到含亞致死劑量的嘧霉胺PDA平板上， 25℃培養(yǎng)5d，于菌落邊緣挑取菌絲接種到另一含嘧霉胺的平板上，逐漸提高嘧霉胺濃度，直至綠僵菌在含1000ug/ml的嘧霉胺平板上能正常生長(zhǎng)，即獲得抗嘧霉胺的抗藥性菌株。 綠僵菌菌株抗藥性水平的確定采用菌落生長(zhǎng)直徑法。將綠僵菌敏感菌株 S 及獲得的抗藥性菌株 RRR3 和R4 分別在 PDA 培養(yǎng)基上 25℃ 預(yù)培養(yǎng) 5d，用直徑 5mm 的打孔器在靠近菌落邊緣打取菌餅。將嘧霉胺與溶化的 PDA 培養(yǎng)基混勻，配成10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml， 1000ug/ml 系列濃度的藥液培養(yǎng)基混合物，于 PDA 培養(yǎng)沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文5基平板中央接種。25℃培養(yǎng) 7 綠僵菌 5d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每處理重復(fù)3 次，以不加藥劑的 PDA 培養(yǎng)基為對(duì)照，計(jì)算嘧霉胺抑制各褐斑病菌菌絲生長(zhǎng)的 EC50及相關(guān)系數(shù) R。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）抗性倍數(shù)大于 10 的為高等抗性，抗性倍數(shù)在 510為中等抗性。 綠僵菌的抗性菌株與敏感菌株產(chǎn)孢量的比較用直徑5mm的打孔器在靠近菌落邊緣打取菌餅，分別取敏感菌株S及抗藥性菌株RRRR5的30個(gè)菌餅置于無(wú)藥 PDA平板上中間位置培養(yǎng)，每一菌株三次重復(fù)，黑暗下25℃培養(yǎng)15d，再用直徑5mm的打孔器在靠近菌落邊緣打取菌餅，取5個(gè)菌餅后再加入5mL無(wú)菌水，沖洗孢子，過(guò)濾得到孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板記數(shù)孢子數(shù)。每個(gè)菌株重復(fù)3次，比較不同菌株產(chǎn)孢量的區(qū)別。 綠僵菌的抗性菌株與敏感菌株絲生長(zhǎng)速率的比較用直徑 5mm 的打孔器在靠近菌落邊緣打取菌餅，分別取誘導(dǎo)后的抗性菌株RRRR4 和敏感菌株 S 的一個(gè)菌餅置于無(wú)藥 PDA 平板上中心位置培養(yǎng)，25℃培養(yǎng) 7d，每個(gè)菌株