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正文內(nèi)容

生物工程專業(yè)畢業(yè)設(shè)計(jì)-金龜子綠僵菌對(duì)熊果酸轉(zhuǎn)化條件的研究(編輯修改稿)

2025-02-09 14:05 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ,備用。精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配制成每1mg/mL的溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液約10mL采用手動(dòng)點(diǎn)樣,點(diǎn)于同一薄層板上,以環(huán)己烷:乙酸乙酯:乙酸(體積比4::3滴)為展開劑,上行展開8cm,取出晾干,分別噴以10%的硫酸乙醇溶液;105℃烘烤5min,觀察結(jié)果。 反相高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的配制:,以甲醇超聲溶解并定容后備用,若溶解太慢或不完全,可適當(dāng)加熱使之快速充分溶解。反向液相色譜條件:柱溫32℃,流動(dòng)相為乙睛:水(V:V)為85:15,檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm,進(jìn)樣方式為手動(dòng)進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10181。L。 菌種的保藏與擴(kuò)增金龜子綠僵菌菌株培養(yǎng)57天后取得孢子,將孢子置于砂土管中冰箱內(nèi)4℃保藏,并且每3個(gè)月用新鮮的斜面及平板培養(yǎng)基活化一次。孢子用茄子瓶PDA斜面培養(yǎng)基28℃下進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。 菌落觀察在PDA平板上培養(yǎng)至出現(xiàn)孢子后觀察菌落形態(tài)和顏色,并在生物顯微鏡下制片鏡檢觀察其的特征。 培養(yǎng)基的選擇 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中碳源種類及適宜濃度的確定分別以20g/L的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉作為唯一碳源,其他條件皆同(其余培養(yǎng)基成分參照液體PDA培養(yǎng)基)。將金龜子綠僵菌的孢子懸浮液按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(100mLPDA液體培養(yǎng)基/250mL搖瓶),在28℃以180r/min振蕩培養(yǎng)48h后菌體進(jìn)入成熟期。加入熊果酸吐溫80溶液2mL(70mg熊果酸,7ml蒸餾水,),繼續(xù)搖床培養(yǎng)60h。比較最終熊果酸的轉(zhuǎn)化率,選擇最優(yōu)碳源。單純改變最優(yōu)碳源的濃度,其他條件不變的情況下,進(jìn)行最優(yōu)碳源的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化影響的單因素實(shí)驗(yàn),得到最終熊果酸轉(zhuǎn)化率,通過比較選擇最佳濃度。分別以25g/L的牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、黃豆粉作為唯一氮源,其他條件皆同(其余培養(yǎng)基成分參照液體PDA培養(yǎng)基)。將金龜子綠僵菌的孢子懸浮液按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(100mLPDA液體培養(yǎng)基/250mL搖瓶),在28℃以180r/min振蕩培養(yǎng)48h后菌體進(jìn)入成熟期。加入熊果酸吐溫80溶液2mL(70mg熊果酸,7ml蒸餾水,),繼續(xù)搖床培養(yǎng)60h。比較最終熊果酸的轉(zhuǎn)化率,選擇最優(yōu)氮源。單純改變最優(yōu)氮源的濃度,其他條件不變的情況下,進(jìn)行最優(yōu)氮源的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化影響的單因素實(shí)驗(yàn),得到最終熊果酸轉(zhuǎn)化率,通過比較選擇最佳濃度。 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中輔助氮源適宜濃度的確定雖然酵母膏也屬于蛋白質(zhì)氮源,但是還含有豐富的維生素和無機(jī)鹽,對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝有非常重要的作用,因此將酵母膏當(dāng)做輔助氮源以為綠僵菌提供各種生長(zhǎng)因子。分別以0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L濃度的酵母膏為輔助氮源,其他條件皆同(其余培養(yǎng)基成分參照液體PDA培養(yǎng)基)。將金龜子綠僵菌的孢子懸浮液按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(100mLPDA液體培養(yǎng)基/250mL搖瓶),在28℃以180r/min振蕩培養(yǎng)48h后菌體進(jìn)入成熟期。加入熊果酸吐溫80溶液2mL(70mg熊果酸,7ml蒸餾水,),繼續(xù)搖床培養(yǎng)60h。比較最終熊果酸的轉(zhuǎn)化率,選擇輔助氮源最適宜濃度。 適宜碳氮源組成的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以得到的最優(yōu)碳源、氮源、輔助氮源進(jìn)行正交設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化,取最適宜濃度以及前后兩個(gè)測(cè)試濃度作為水平測(cè)試。 無機(jī)鹽K2HPO4適宜濃度的選擇、單獨(dú)考察K2HPO4對(duì)轉(zhuǎn)化的影響,并選擇最適濃度。 孢子懸浮液的配制將斜面培養(yǎng)基的菌株在無菌操作條件下接種到事先滅過菌的三角瓶中,配成107個(gè)/mL的孢子懸浮液(血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))。如該孢子懸浮液未達(dá)預(yù)期濃度,繼續(xù)接種孢子,如該孢子懸浮液高于預(yù)期濃度,則可加入適量的無菌水來稀釋。孢子懸浮液可在4℃冰箱中保存1個(gè)月以上活性不變,使用時(shí)間最好不超過1個(gè)月。 菌株培養(yǎng)與熊果酸的轉(zhuǎn)化將金龜子綠僵菌的孢子懸浮液按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(100mLPDA液體培養(yǎng)基/250mL搖瓶),在28℃以180r/min振蕩培養(yǎng)48h后菌體進(jìn)入成熟期。加入熊果酸吐溫80溶液2mL(70mg熊果酸,7ml蒸餾水,),繼續(xù)搖床培養(yǎng)60h。 發(fā)酵產(chǎn)物粗品的提取與檢測(cè)對(duì)反應(yīng)后的產(chǎn)物碾碎后用2倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯提取,超聲提取30分鐘,乙酸乙酯層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干得到含有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的粗品結(jié)晶,粗品結(jié)晶用甲醇溶解。用TLC法檢測(cè),流動(dòng)相條件為環(huán)己烷:乙酸乙酯:乙酸為4::2滴,顯色劑為10%硫酸乙醇溶液。 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在發(fā)酵體系中的分配測(cè)定酶催化轉(zhuǎn)化結(jié)束后,首先將轉(zhuǎn)化體系減壓過濾,固液分離以得到菌絲體和濾液。由于酶轉(zhuǎn)化時(shí)間較長(zhǎng),不可避免會(huì)出現(xiàn)菌絲體自溶現(xiàn)象,以致濾液中會(huì)有殘留的菌絲體碎片,因此還需要對(duì)濾液進(jìn)行離心。菌絲體用研缽碾碎后用3倍轉(zhuǎn)化液體積的乙酸乙酯于常溫下提取攪拌1h后,其有機(jī)相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干得到含有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的粗品結(jié)晶。濾液離心物用等轉(zhuǎn)化液體積的乙酸乙酯進(jìn)行提取,有機(jī)相處理方法重復(fù)以上步驟。濾液用等量的乙酸乙酯萃取后靜置30min分層,棄去水相,有機(jī)相處理重復(fù)以上步驟。粗品分別用甲醇溶解,用TLC法進(jìn)行分析。 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離與檢測(cè)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行正相硅膠柱分離,選取100200目的硅膠于105℃恒溫活化30min,用洗脫劑浸泡過夜,勻漿濕法裝柱,用洗脫劑以一定流速淋洗色譜柱使之達(dá)到平衡狀態(tài),按50:1(硅膠:樣品)體積上樣,洗脫劑為環(huán)己烷:乙酸乙酯:乙酸,先后按8:1:2滴,6:1:2滴和4:1:2滴進(jìn)行柱層析,用試管收集洗脫液,每管10mL,利用薄層層析法跟蹤監(jiān)測(cè)含有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的試管,把相同的含有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的試管合并,揮干溶劑后繼續(xù)進(jìn)制備液相純化,得到純的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。對(duì)純的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行液相檢測(cè)以及1H NMR和13C NMR經(jīng)BRUCKER AV400型核磁共振儀進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)表征,并通過ESIMS確定它的分子量。 金龜子綠僵菌自身代謝產(chǎn)物與加入熊果酸后代謝產(chǎn)物的比較,金龜子綠僵菌的自身代謝產(chǎn)物即在相同的外界條件下培養(yǎng),反應(yīng)過程中不加入熊果酸吐溫溶液,按照相同的處理方法得到金龜子綠僵菌的自身代謝產(chǎn)物。然后通過液相檢測(cè)對(duì)比兩結(jié)果。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 金龜子綠僵菌菌落與孢子觀察結(jié)果金龜子綠僵菌在PDA平板上28℃下培養(yǎng)三天后,在PDA培養(yǎng)基上菌落呈薄棉狀,嚴(yán)實(shí),暗綠色,表面凹凸不平,培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)后,在暗綠色菌落表面生長(zhǎng)出粒狀或者片狀稠密白色絨毛。綠色菌落在顯微鏡下觀察為扁長(zhǎng)的孢子,透明,單胞,數(shù)目多。白色絨毛在顯微鏡下觀察為菌絲分支,有隔,無色光滑。 適宜斜面培養(yǎng)時(shí)間的確定霉菌孢子是一個(gè)獨(dú)立的遺傳體,遺傳物質(zhì)比較完整,因此孢子用于傳代和保存均能保持原始菌種的基本特征。斜面孢子28℃恒溫培養(yǎng)57d,孢子完全成熟,此時(shí)顯微鏡下可見到大量豐滿成熟的孢子,從外觀看斜面呈暗綠色,孢子完全覆蓋斜面。如果繼續(xù)培養(yǎng),菌落開始有褶皺,在暗綠色菌落表面生長(zhǎng)出粒狀或者片狀稠密白色絨毛,過于衰老的孢子會(huì)影響酶催化能力。因此,斜面孢子的培養(yǎng)時(shí)間確定為57d。 轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物在體系中的分配情況酶轉(zhuǎn)化結(jié)束后,對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行處理后,TLC檢測(cè)結(jié)果如圖2所示:1 2 3 4 圖2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化體系中的分配情況(1)熊果酸原料樣;(2)上清液;(3)濾液離心沉淀;(4)菌絲體從圖中可以看出,熊果酸衍生物主要位于菌絲體內(nèi)部或者吸附于菌絲體表面,而在上清液中分布得較少。由于目的產(chǎn)物的含量太少會(huì)導(dǎo)致提取分離十分困難,又考慮到萃取需要耗費(fèi)較為昂貴的乙酸乙酯,因此對(duì)上清液中的產(chǎn)物可忽略不計(jì),可以采取菌絲體與濾液離心沉淀物合并后再進(jìn)行提取的方法。 培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基方案設(shè)計(jì)不僅要滿足微生物菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需要,而且要滿足產(chǎn)生高活性羥化酶的基質(zhì)需要。在選擇發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí),考察的指標(biāo)是培養(yǎng)的菌體對(duì)底物的轉(zhuǎn)化能力的高效、穩(wěn)定。 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中碳源種類的確定培養(yǎng)基中的碳源是主要的營(yíng)養(yǎng)成分之一,是菌體生命活動(dòng)所需能力的主要來源。改變轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的碳源種類,分別以20g/L的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉作為碳源進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖可知,金龜子綠僵菌利用以上碳源轉(zhuǎn)化底物時(shí),轉(zhuǎn)化率由高到低依次是葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉??梢?,葡萄糖是該菌株的最佳碳源。葡萄糖是最易被微生物利用的碳源,可加速微生物的生長(zhǎng)。除此之外,在微生物酶催化羥基化的過程需要NADPH的參與,而菌體在消耗葡萄糖的過程中正好能提供充足的NADPH。因此葡萄糖最有利于金龜子綠僵菌的生長(zhǎng)和底物的轉(zhuǎn)化。圖3 不同碳源對(duì)熊果酸轉(zhuǎn)化的影響 初始葡萄糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響單純改變葡萄糖的濃度,其他條件不變的情況下,進(jìn)行葡萄糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化影響的單因素實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4。圖4 葡萄糖濃度對(duì)熊果酸轉(zhuǎn)化的影響從圖可看出,葡萄糖濃度為20g/L時(shí),熊果酸的轉(zhuǎn)化率最高,當(dāng)葡萄糖濃度繼續(xù)增高時(shí),轉(zhuǎn)化率下降。葡萄糖作為菌體最依賴的碳源,其濃度的高低與菌體生長(zhǎng)和酶催化反應(yīng)有密切的關(guān)系。葡萄糖代謝主要為NADPH的再生服務(wù)并由此間接調(diào)節(jié)酶活力。葡萄糖缺乏引起的碳源不足將使菌體生長(zhǎng)受到限制,使羥化作用停止。葡萄糖濃度過高時(shí),由于滲透壓過大,不利于提高氧的傳遞速度,對(duì)菌體生長(zhǎng)不利,酶合成也會(huì)受到阻遏,阻礙轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行。 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中主要氮源種類的確定氮源是構(gòu)成菌體細(xì)胞蛋白和核酸的物質(zhì)來源。酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì),因此酶的合成需要氮源,尤其對(duì)于生物轉(zhuǎn)化過程中的酶,合適并足量的氮源是必不可少的。因此,本實(shí)驗(yàn)主要考察質(zhì)量濃度均為25g/L蛋白胨、玉米漿、牛肉膏、黃豆粉進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖5。圖5 不同氮源對(duì)熊果酸轉(zhuǎn)化的影響從圖可看出,氮源為玉米漿時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。這是因?yàn)橛衩诐{為速效氮源物質(zhì),主要以較易吸收的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物形式存在,而降解產(chǎn)物特別是氨基酸可以通過轉(zhuǎn)氨作用直接被機(jī)體利用,而黃豆粉中的氮主要以大分子蛋白質(zhì)形式存在,需要進(jìn)一步降解成小分子的肽和氨基酸后才能被微生物吸收利用。因此,玉米漿有利于菌體的生長(zhǎng),提高菌絲體濃度,從而增加了酶的含量。 初始玉米漿濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響在保證其他組分不變的條件下,考察不同玉米漿濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響,結(jié)果如圖6所示。圖6 玉米漿濃度對(duì)熊果酸轉(zhuǎn)化的影響由圖可看出,玉米漿少于20g/L時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)有明顯不利影響。而豐富的氮源可以提高轉(zhuǎn)化率,且當(dāng)玉米漿達(dá)到25g/L時(shí),熊果酸的轉(zhuǎn)化率最高。 初始酵母膏濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響雖然酵母膏屬于蛋白質(zhì)類氮源,但是其含有豐富的維生素和無機(jī)鹽,對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝有非常重要的作用,因此需把酵母膏當(dāng)做輔助氮源。本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)考察了酵母膏對(duì)轉(zhuǎn)化的作用,結(jié)果如圖7。圖7 酵母膏濃度對(duì)熊果酸轉(zhuǎn)化的影響圖7表明,酵母膏在生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化的過程中起了重要的作用,培養(yǎng)基中無酵母膏時(shí),轉(zhuǎn)化率最低。當(dāng)酵母膏濃度達(dá)到了3g/L時(shí),轉(zhuǎn)化率能維持較高水平。 適宜碳氮源組成的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基各組分之間有一定的內(nèi)在聯(lián)系,各種最優(yōu)單因素的組合并不一定能獲得最佳的發(fā)酵結(jié)果,因此需進(jìn)行正交設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化,以確定最佳培養(yǎng)基配方。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,主要考察葡萄糖、玉米漿、酵母膏三個(gè)因素,考慮的因素及其水平見表3。根據(jù)因素和水平,采用正交表L9(34)進(jìn)行了9組實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4。表3 培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平水平因素/(g/L)葡萄糖(A)玉米漿(B)酵母膏(C)空白列(D)118220220250322280表4 培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果序號(hào)葡萄糖/(g/L)玉米漿/(g/L)酵母膏/(g/L)空白列轉(zhuǎn)化率/%標(biāo)準(zhǔn)偏差118220218250318280420220520250620280722220822250922280運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果如表5所示。 表5 培養(yǎng)基單因素統(tǒng)計(jì)Mean95%Confidence IntervalLower BoundUpper Bound葡萄糖(A)123玉米漿(B)123酵母膏(C)123空白列(D)123表5顯示了各因素不同水平的平均值,從結(jié)果直觀分析,各因素水平對(duì)結(jié)果影響的強(qiáng)弱順序是A2>A3>A1,B2>B3>B1,C2>C3>C1。表6 培養(yǎng)基方差分析因素SSdfMSFp葡萄糖2玉米漿2酵母膏2Error2Total SS8從表6分析,三個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化率均無顯著性影響,影響因子主次順序?yàn)椋航湍父啵酒咸烟牵居衩诐{。確定最佳轉(zhuǎn)化條件為:葡萄糖、玉米漿、
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