【正文】 酵培養(yǎng)基含硒量為 0μg/L 時 ，菌絲球干重最大 。菌絲體的含硒量與干重 的關(guān)系不明顯 ?？梢?適宜 濃度的發(fā)酵液硒含量有助于 白色金針菇 誘變5min 菌種 的生長及其富硒能力的提高。 因此， 金針菇 白 .0 菌種在培養(yǎng)基含硒量為 20μg/L 的時候，富硒能力及生長速度均達到最大，即 。在測定 發(fā)酵終點 pH值時，緩沖液的實時溫度是 ℃，緩沖液的 pH值按照 20℃的標(biāo)準(zhǔn)來校正 pH計。在測定發(fā)酵終點 pH 值時，緩沖液的實時溫度是 24℃，緩沖液的 pH 值按照 25℃的標(biāo)準(zhǔn)來校正 pH計。 其次，利用紫外分光光度法測定白色金針菇、金 針菇 201 及其誘變菌株的單位質(zhì)量下的含硒量。 富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 10 3 結(jié)果與分析 （討論） 紫外誘變對金針菇形態(tài)學(xué)特征的影響 紫外誘變 實驗中 ，選擇金針菇 201 和白色金針菇兩個菌種。依次加入 40%鹽酸羥胺溶液 2mL、 、 1:1(V/V)磷酸溶液 2mL,加塞搖勻 1min。 ② 提硒 打開水浴鍋，溫度設(shè)定為 100℃ 。在大大小小的菌絲球中，選擇其中較大的 3個和較小的 3 個，使用游標(biāo)卡尺測定這 6個菌絲球的直徑，從而得出該培養(yǎng)基菌絲球的直徑范圍。 ② 測定 菌落 半徑 利用 十字交叉法 ，用游標(biāo)卡尺測定 菌 落 生長 直徑。 ② 分裝 取干凈的錐形瓶 48套。 ④ 平板無菌檢驗 將已滅菌的斜面置于 25℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 3d，只有培養(yǎng)基表面及基質(zhì)內(nèi)無任何雜菌菌落出現(xiàn)，說明已達到滅菌目的，才可使用。配置固化 CM 培養(yǎng)基，分裝至錐形瓶中， 200mL/個，搖勻，獲得各個硒濃度梯度的固化 富硒 CM 培養(yǎng)基 母液 。 菌種保藏的 原理就是通過降低營養(yǎng)、 缺氧 、干燥、低溫等手段，降低菌株的新陳代謝， 使菌種暫時處于休眠狀態(tài)， 抑制菌絲的生長和繁殖，從而降低其變異率。 ⑩ 菌絲體紫外誘變 將超 凈臺面清理干凈，使用酒精棉球蘸上酒精，擦拭超凈臺面。趁熱倒平板， 培養(yǎng) 皿的握法 如下： 將已滅菌的培養(yǎng)皿放置在超凈臺上。取 6套培養(yǎng)皿，使用報紙包扎 起來。將灼燒過的接種鉤伸入母種試管內(nèi)，放在試管內(nèi)壁停留片刻使之冷卻以免燙傷菌種。 ③ 取 75%酒 精 棉 球 蘸上 75%酒精擦拭雙手、超凈臺的工作臺面、接種工具、金針菇母種試管的表面。 使用 75%乙醇將超凈臺的工作臺面和小木條消毒。分裝時不要讓培養(yǎng)基沾在大試管口上，若以沾上，要用干凈紗布擦干凈。 并加水至 1000ml。 甲苯 。因此，研發(fā)富硒食品具有非常重要的意義。 人體所適宜的 膳食 硒濃度 硒元素是人體內(nèi)不可缺少的必需元素， 硒缺乏克山病、大骨節(jié)病 。 結(jié)論： 相對于固體平板培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體的生長速度及富硒能力達到 新的高度 。 目前對金針菇的營養(yǎng)成分報道較多，本文對金針菇菌絲體及其紫外誘變體的最佳富 硒能力的培養(yǎng)基硒含量、菌絲生長特性、平板富硒培養(yǎng)與液體富硒培養(yǎng) 、菌絲體硒含量等做了探討。硒的缺乏將容易導(dǎo)致大骨節(jié)病和克山病的產(chǎn)生 [2]，以及 與免疫功能的喪失、癌癥的發(fā)生有著較大的關(guān)系 [3]，以及是體內(nèi)紅細(xì)胞 谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成部分 [4]。不同的硒濃度，其產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)是不同的。 ② 培養(yǎng)基用試劑 馬鈴薯 、 葡萄糖 、 KH?PO?、 硫酸鎂 、 瓊脂 、 維生素 B?、 水 、 K?HPO?、 蛋白胨 ③ 硒儲備液 （配合 固化 CM培養(yǎng)基 和 液體 CM 培養(yǎng)基 ，制備不同硒濃度富硒培養(yǎng)基 ） 使用分析天平稱取 亞硒酸鈉 ，溶解 于蒸餾水中，定容至 100ml，此溶液含硒 1g/L； 稀釋至含硒 1μg/ml，獲得硒儲備液 。將切好的馬鈴薯小塊放入 1000ml 水中，電爐加熱煮沸后用文火保持 30min，此間應(yīng)注意用玻璃棒攪拌，防止溶液上層漫出。 ⑧ 分裝試管 先在玻璃漏斗嘴上套一段乳膠管，卡上止流夾，將培養(yǎng)基倒入漏斗中。 對于錐形瓶，直接 將橡膠塞塞上，包上 牛皮紙。在高溫季節(jié)，培養(yǎng)基滅菌后，待鍋內(nèi)溫度降至 50℃ 時，取出大試管， 將 大 試管頭部枕在 小 木條上，使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜， 斜面長度為試管長度的 ?， 覆蓋保溫物讓其自然緩慢冷卻， 凝固后即成斜面培養(yǎng)基。右手拿接種鉤，在裝有酒精的瓶子中蘸一下，然后在火焰上燒紅，進行灼燒滅菌。將接種鉤在火焰上灼燒至紅，放回超凈臺。內(nèi)部裝有綜合馬鈴薯培養(yǎng)基的錐形瓶放置在鍋內(nèi)，水浴加熱。 ⑧ 超凈臺 的滅菌 ⑨ 接種 點燃酒精燈，將復(fù)壯后的白色金針菇和金針菇 201，使用接種鉤， 在菌絲濃白粗壯處 取出 178。 ③ 每次轉(zhuǎn)管都應(yīng)在菌絲濃白粗壯處挑取菌種塊。 固化 富硒 培養(yǎng) 本次實驗，我 將培養(yǎng)基富硒濃度梯度設(shè)置為 0、 1 2 340(μg/L)[12]。取出錐形瓶，將 200mL富硒 CM 培養(yǎng)基 母液 分裝至 6 套培養(yǎng)皿。 ① 配置液體 富硒 CM 培養(yǎng)基 取 8個錐形瓶編號。設(shè)置一不接種的、不含硒的空白對照。收集菌絲體于稱量瓶，在電熱恒溫干燥箱（溫度設(shè)置為 60℃ ）中烘干至恒重，用 電子分析天平 稱其干重。 紫外分光光度法測定金針菇菌絲體中的含硒量 在參考文獻地基礎(chǔ)上 [16]， 我們做了改進 ： 明確了硫酸高氯酸消化時間和水浴鍋加熱反應(yīng)時間， 我們通過在通風(fēng)處操作以及將錐形瓶蓋上塞子，防止具有刺激性氣味的白霧進入空氣，危害身體健康， 將其中激烈反應(yīng)這一并不明顯的特征表現(xiàn)刪除， 將冒白煙這一特征改成冒白霧，其出現(xiàn)的時間我們按照實驗事實做了更正， 使用 100℃ 水浴鍋代替電沙浴達到節(jié)能效果， 菌絲體與子實體不同，我們根據(jù)實驗，將文獻中加分析純 改為 ， 明確提醒出可能會出現(xiàn)問題的地方，防止操作不慎產(chǎn)生惡果， 提醒使用塑料瓶盛裝濃 NaOH 溶液， 硫酸高 氯酸消解液配置好后應(yīng)避光保存 ， 因 EDTA溶解度較低，實驗中使用 EDTA 二鈉鹽代替 EDTA。向溶液中加入蒸餾水 35mL。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別 取硒 標(biāo)準(zhǔn)液 0， ， ， ， ， ， 于 250 mL錐形瓶中 ，相當(dāng)于分別含硒 0， 6， 12， 18， 24， 30μg/mL， 經(jīng)過消化、提硒、萃取、測定步驟后，獲 得其在 335nm處的 吸收 值 。 觀察 發(fā)酵液的濁度，菌絲球的色、香、味 及其形狀 ，測定菌液 pH 和菌絲球直徑，測菌絲球數(shù)目及其干重 ，記錄各個菌種各個梯度菌絲球干燥所需的時間 。 該曲線僅用于金針菇 201 菌 種及其誘變菌種在液體發(fā)酵中所獲得的菌絲體富硒能力的測量。在本實驗中，我觀察到，菌絲球小的培養(yǎng)液中菌絲球的數(shù)目多，生物量也大，干燥時間也比較快。菌絲體的含硒量與干富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 14 0501001502002503003504000 5 10 15 20 25 30 40硒濃度梯度菌絲體含硒量(μg/g)00 . 0 50 . 10 . 1 50 . 20 . 2 50 . 3干重(g)菌絲體含硒量干重重呈正相關(guān)。在所測 硒濃度范圍內(nèi)，菌絲體的富硒能力 出現(xiàn)了兩個峰值 ， 分別是 在培養(yǎng)基硒含量為 0 和 30μg/L 時富硒能力最強。 圖 5 白色金針菇 （ 白 .10） 菌種 菌絲體含硒量和干重與硒濃度梯度的曲線圖 Curves of the selenium and dry weight of mycelium of Flammulina velutipes () in different selenium concentration gradient 由表 8 和圖 5 可知， 白色金針菇 誘變 10min 菌種 在富硒 CM 液體培養(yǎng)基上 具有較強的富硒能力。 表 9 金針菇 201 原種 ()在液體富硒培養(yǎng)基中對硒的富集特性 Table 9. Seaccumulated characteristics of Flammulina velutipes 201 in the seleniumenriched medium 培養(yǎng)液硒 濃度 (μg/L) 生物量 干重 (g/100mL) 菌絲體的 吸光值 菌絲體 含硒量 (μg/g) 硒含量 提高倍數(shù) 硒回收率 （％） CK 5 10 15 20 25 30 40 注：每個硒濃度梯度下，均取 干重進行測吸收值。 表 10 金針菇 201 誘變 5min 菌種 ()在液體富硒培養(yǎng)基中對硒的富集特性Table characteristics of Flammulina velutipes () in the seleniumenriched medium 培養(yǎng)液硒 濃度 (μg/L) 生物量 干重 (g/100mL) 菌絲體的 吸光值 菌絲體 含硒量 (μg/g) 硒含量 提高倍數(shù) 硒回收率 （％） CK 5 10 15 — — — — — 20 25 30 40 注：每個硒濃度梯度下，均取 干重進行測吸收值。 綜合考慮菌種生長速度、富硒能力及發(fā)酵培養(yǎng)基硒含量的回收率， 因而較好的培養(yǎng)方案為配置含硒量為 20μg/L的培養(yǎng)基發(fā)酵 金針菇 201 誘變 5min 菌種 菌絲體。 因此， 金針菇 201 誘變 10min 菌種 在培養(yǎng)基含硒量為 5μg/L 的時候，富硒能力最強，即 ； 在 培養(yǎng)基含硒量為 30μg/L 的時候，生長速度均達到最大，即 。 通過測定金針菇菌各個菌種菌絲體的菌落直 徑、菌絲密度、有機物消耗量、菌絲外觀及菌絲直徑范圍等特性，從而反映金針菇各個菌種在平板上富硒培養(yǎng)的不同特性。 富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 21 表 12 目鏡 測微尺的校正 Table 12. Calibration of eyepiece micrometer 接物鏡 倍數(shù) 目鏡測微尺 格數(shù) 鏡臺測微尺 格數(shù) 目鏡測微尺 每格代表的長度 (μ m) 4 80 100 10 80 50 40 80 10 注：鏡臺測微尺每格 ，本次實驗我使用 40物鏡測量菌絲直徑。 白色金針菇誘變 10min 菌種，在 10μg/L 的硒濃度時，菌落生長較快，菌絲最濃密，菌 絲外觀粗壯。但是在適宜硒濃度下菌絲體的有機物消耗量出現(xiàn)峰值。可見誘變 10min 后，菌絲生長對硒濃度顯得比較敏感。 由表 13 可知： 白色金針菇原種的菌絲體在較低的硒濃度梯度下菌落直徑和有機物消耗量比較大，菌絲密度高，菌絲外觀比較粗壯。 通 過對上述菌株的生長狀況進行了詳細(xì)的記錄與觀察，得到不同富硒濃度對金針菇菌絲體的影響的結(jié)論。 金針菇在平板富硒培養(yǎng)中的特性 金針菇 菌絲 在平板上 培 養(yǎng) 、干燥 后 ，使用紫外分光光度法測定其單位質(zhì)量下的含硒量。 圖 8:金針菇 201 誘變 10min 菌種 菌絲體含硒量和干重與硒濃度梯度的曲線圖 富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 20 Curves of the selenium and dry weight of mycelium of Flammulina velutipes () in different selenium concentration gradient 由表 11 和圖 8 可知， 金針菇 201 誘變 10min 菌種 在富硒 CM 液體培養(yǎng)基上 具有較強的富硒能力。 菌絲體的含硒量、干重與硒濃度的關(guān)系不顯著。菌絲體的富硒能力隨著硒濃度的增加而 上下波動 ，在培養(yǎng)基硒含量為 15 和 40μg/L 時菌絲體含硒量曲線出現(xiàn)三處峰值，但在 5μg/L 時其富硒能力遠高富硒金針菇菌株的選育畢業(yè)論文 18 5 00501001502000 5 10 15 20 25 30 40硒濃度梯度菌絲體含硒量(μg/g) 0 . 0 500 . 0 50 . 10 . 1 50 . 20 . 2 50 . 3干重(g)菌絲體含硒量干重于其他兩個梯度。 其 菌絲球干重， 在 15μg/L 的硒濃度的時候達到了頂峰，顯著高于所測 的 其他 硒 濃度 梯度 。 菌絲球干重 在該 硒濃度范圍內(nèi)，在 5μg/L 時 達到了頂峰。隨著培養(yǎng)基硒濃度梯度的增加，硒的回收率呈下降趨勢。2)轉(zhuǎn)速為 250r/min,溫度為 25℃； 3）在測定滅菌前 pH值時，緩沖液 的實時溫度是 12℃，緩沖液的 pH 值按照 10℃的標(biāo)準(zhǔn)來校正 pH 計。2)轉(zhuǎn)速為 250r/min,溫度為 25℃； 3）在測定滅菌前 pH值時，緩沖液的實時溫度是 ℃，緩沖液的 pH 值按照 20℃的標(biāo)準(zhǔn)來校正 pH 計。實驗中的結(jié)果分 別在下列的表格和數(shù)據(jù)圖形中一 一列出。以吸收值 A對硒含量回歸，獲得回歸方程。反應(yīng)放熱并有刺激性氣體富硒金針