【文章內(nèi)容簡介】 種生態(tài)災(zāi)難。如何有效地利用微囊藻資源，使其變廢為寶是必須正視的問題，銅綠微囊藻多糖的開發(fā)和利用早已成為資源開發(fā)的熱點。銅綠微囊藻無論在胞內(nèi)還 是胞外都能分離得到富含糖醛酸和硫酸基團的酸性多糖，展現(xiàn)出銅綠微囊藻作為藍藻酸性多糖提取的豐富資源的可貴前景。本實驗旨在研究銅綠微囊藻多糖的提取優(yōu)化條件，為微囊藻多糖的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)研究、分離純化奠定基礎(chǔ)，也為生物活性研究和藥理藥效研究作鋪墊，充分利用這一寶貴資源為資源整合和利用做出貢獻。 、試劑和儀器 銅綠微囊藻，在巢湖采集，經(jīng)在安徽大學環(huán)境科學學院冷凍凍融后，成為可利用的藻漿。 （ 1）無水乙醇：上海振業(yè)化工有限公司 3 （ 2） 正丁醇：上海申博化工有限公司 (3)三氯甲烷 :國藥集 團化學試劑有限公司 以上試劑均為分析純。 儀器設(shè)備 （ 1）電子天平 ：上海越平科學儀器有限公司 （ 3） DKS24型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司 （ 4） TDL5M臺式大容量冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司 （ 5） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責任公司 (6） TD5AWS臺式低速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司 （ 7）冷凍干燥機：德國 CHRIST生產(chǎn) （ 9） 冰箱：榮事達 （ 10） 烘箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司 3 方法 藍藻多糖提取工藝路線 藍藻藻漿→熱水法浸提多糖→ 離心后過濾去殘渣→ 收集 上清液→上清液濃縮至 810ml→濃縮液 加 5 倍體積 乙醇沉淀（隔夜沉淀）→離心去上清液留沉淀→沉淀加水后抽干乙醇至溶液 8ml左右→冷凍干燥→粗多糖→稱重→計算粗多糖得率 分別測定不同溫度，時間，料液比，凍融次數(shù)，溶菌酶濃度對粗多糖得率的影響。 分別以不同的溫度、水料比、提取時間，凍融次數(shù)及溶菌酶濃度做單因素試驗 , 考察各單因素對多糖得率的影響。 藍藻多糖提取的中心組合實驗 根據(jù) Box Benhnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定 中心組合試驗因素與水平，以多糖得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析對提取條件進行優(yōu)化。試驗因素及水平編碼如表 1所示。 具體試驗設(shè)計方案見表 2。 4 表 1 中心組合設(shè)計的因素與水平表 Table1. Variables and levels in the design of the center bination experiment 變量 代碼 編碼水平 1 0 1 提取溫度 /℃ A 40 60 80 提取時間 /h B 3 4 5 料液比 /ml/g C 40 50 60 對提取溫度 A、提取時間 B和液料比 C作變換如下： A=(T － 60)/20， B=(t － 4)/1， C=(z － 50)/10， (T、 t、 z 分別為試驗提取溫度、提取時間及液料比 )。以 A、 B、 C 為自變量， 以 2次試驗所得多糖提取率的平均值為響應(yīng)值 (R1)。 數(shù)據(jù)處理 每組實驗均設(shè)定二個平行實驗，結(jié)果求平均值，然后運用 Design Expert 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。 4 結(jié)果與分析 單因素提取對水溶性多糖得率的影響 提取溫度對多糖得率的影響 以 30 mL /g 的料液比，分別于 50、 60、 70、 80、 90 ℃下提取 4 h，并以 95%的乙醇沉淀，醇沉比為 1︰ 5。 結(jié)果如圖 1， 由圖可知，隨著溫度的升高，多糖的提取率逐漸增加，且增幅明顯，當溫度增 到 70℃ 左右后增幅變小， 80℃時多糖的提取率最高，之后隨著溫度的增加，多糖提取率逐漸減小。這里考慮到藍藻多糖還有很多后續(xù)研究，為了保持多糖結(jié)構(gòu)不被嚴重破壞，應(yīng)選擇提取溫度在 6070℃ 之間為宜。 5 圖 1 提取溫度對多糖得率的影響 Effects of temperature on polysaccharides extraction rate 水料比對多糖得率的影響 在 提取 溫度為 60 ℃下，分別以 50mL /g 的料液比提取 4h，并以 95%的乙醇沉淀。 結(jié)果見圖 2， 由圖 2 可知，多糖提取率隨液料比的增大而呈上升趨勢，這是由于加液量越大則提取出來的多糖越容易溶解，損失就越少，但料液比到達 30ml/g 左右時多糖提取率增幅不大，提取率緩慢增加。增大液料比雖有利于多糖提取，但會增大后續(xù)濃縮的時間與能耗，所以從成本考慮料液比應(yīng)在 3040mL /g 左右。 圖 2 料液比對多糖得率的影響 of liquid/solid ratio on yield of polysaccharides 影響 在 提取 溫度為 60℃下，以 30mL/g 的料液比進行提取，時間分別為 5 和 6h，并以 95%的乙醇沉淀。 結(jié)果見 圖 3， 由圖 3 可知，多糖提取率隨著提取時間的增長，呈現(xiàn)先上升再穩(wěn)定的總體趨勢，在 4 h 左右出現(xiàn)最大值 ,隨后增幅不明顯。說明 提取 產(chǎn)物浸出過程與時間密切相關(guān)，時間過短，產(chǎn)物溶解不充分，但時間過長，又可能會引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化。單因素試驗的結(jié)果顯示，提取時間應(yīng)在 45h 左右。 6 圖 3 提取時間對多糖得率的影響 Effects of time on polysaccharides extraction rate EDTA對多糖得率的影響 在提取溫度為 60℃ ,料液比為 30mL/g及其它情況保持不變的情況下 ,加入 0g、 、 、 、 ，根據(jù)實驗結(jié)果得圖 4，加入溶菌酶對多糖得率并沒有什么正面促進作用，隨著溶菌酶量的增多，多糖提取率反而不斷下降。然而，加入溶菌酶的同時，每組加入同等量的 EDTA，效果就不一樣，多糖提取率總體都因為 EDTA的加入而升高，如紅色趨勢線所示，隨著溶菌酶量變多，多糖提取率先增加后慢慢減少，并在溶 菌酶量為 達到最大值。所以試驗中，為保證獲得更多的多糖，可以加入適量的溶菌酶和 EDTA來提高產(chǎn)率。 圖 4溶菌酶和 EDTA對多糖得率的影響 Effects of lysozyme and EDTA on polysaccharides extraction rate