【文章內(nèi)容簡介】 各種培養(yǎng)基中菌絲體的干重。④此實驗要進行三次重復(fù)實驗。菌絲體干重為三次實驗的平均值。（8）優(yōu)化培養(yǎng)基驗證實驗由以上實驗可知：最優(yōu)碳源為玉米粉、最優(yōu)氮源為黃豆餅粉、最適 pH 在～ 之間。利用優(yōu)化得來的結(jié)果，按照表 配制培養(yǎng)基，分裝，在壓力為 、溫度為 121℃的情況下滅菌 20min，待冷卻后接種，并在溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為 130r/min 的條件下用搖床培養(yǎng) 7 天后，按照 中步驟操作測桑黃菌絲體的干重。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XVIII重復(fù)三次實驗，桑黃菌絲體干重為三次重復(fù)實驗的平均值。與此同時，用 PDA 液體培養(yǎng)基作為對照組，并重復(fù)三次實驗。表 優(yōu)化培養(yǎng)基的配方品名 玉米粉 黃豆餅粉 KH2PO4 MgSO4 維生素 B1 維生素 B2 pH配比(g/100mL) 3 1 ～ 多糖提取工藝優(yōu)化 乙醇濃度對多糖收率的影響（1）培養(yǎng)液濃縮 將培養(yǎng)液定量，用反滲透膜濃縮為原體積的 1/2，濃縮壓力 。反滲透膜濃縮操作：接通電源，電源指示燈亮，打開工作泵，調(diào)節(jié)濃縮液調(diào)壓閥將壓力調(diào)節(jié)到 Mpa，開始工作。（2）向濃縮后的培養(yǎng)液加入原體積 3 倍的乙醇，產(chǎn)生灰白色沉淀，將上述提取液放入冷藏柜，在 4℃下靜置一夜。以發(fā)酵液中多糖含量為依據(jù)，改變乙醇的濃度，以確定最佳提取工藝。見表 。表 改變乙醇濃度組別 1 2 3乙醇濃度（%） 75 85 95（3）將上述提取液用離心機分離，3000r/min，離心 10min，得到桑黃多糖，離心得到上清液（乙醇）回收。（4）將離心所得沉淀（桑黃多糖）用冷凍干燥機中干燥，得到的產(chǎn)品用精密電子天平稱量，記錄數(shù)據(jù)。 胞內(nèi)多糖提取實驗優(yōu)化采用單因素實驗法，選擇影響提取多糖含量的 3 個主要因素煎煮時間、固液比和水煮次數(shù)，其他因素不變，稱取等量的干菌絲體粉末，每個因素 3 個水桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XIX平，以提取多糖的質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，對比分析，從而優(yōu)化得到菌絲體提取多糖的最佳工藝。步驟 ：（1）將分離出來的菌絲體放入恒溫干燥機中，在 60～65℃下干燥； 恒溫干燥機的操作：首先插上電源，打開開關(guān)，設(shè)定干燥的溫度，干燥菌絲體需要 60℃，同時設(shè)定溫度的上限 65℃，將預(yù)備干燥的菌絲體用器皿裝好，放入干燥箱中，關(guān)閉干燥箱門，按下接通按鈕，開始干燥。（2）干燥結(jié)束，將菌絲體研磨成粉狀，然后稱取 9 份等量的菌絲體粉末，進行優(yōu)化實驗。分別按照表 、表 和表 的設(shè)計進行蒸煮實驗。表 改變水煮時間組別 1 2 3水煮時間（h） 1 2表 改變水煮次數(shù)組別 4 5 6水煮次數(shù)（次） 1 2 3表 改變固液比組別 7 8 9固液比 1: 1:10 1:③將水煮液 3000r/min 離心 10min，分離得到上清液。④將上述上清液用反滲透膜濃縮為原體積的 1/2，操作同上。⑤下面用胞外多糖提取的方法提取菌絲體多糖并記錄數(shù)據(jù)及結(jié)果。 超聲波處理時間對多糖收率的影響本實驗將除時間外的其他提取條件設(shè)置為料液比 1:10，超聲波提取溫度60℃，功率 400W。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XX（1） 稱取 5 份桑黃菌絲體粉末，每份 10g，置于燒杯中，編號 1～5，加入蒸餾水并加熱到 60℃。（2）將上述 5 組混合物進行超聲波處理，時間分別為10min、15min、20min、25min、30min。（3）水煮 1h，冷卻后（4℃）分別加入 95%乙醇。（4）離心去除上清液，所的沉淀冷凍干燥并稱量。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XXI第 3 章 試驗數(shù)據(jù)及分析 桑黃菌絲液體培養(yǎng)工藝數(shù)據(jù)及分析 桑黃生長曲線與桑黃多糖積累曲線的繪制（1）實驗記錄表測定桑黃生長曲線時，桑黃菌絲體干重以及胞內(nèi)外多糖隨培養(yǎng)時間的記錄表見表 31。表 桑黃菌絲體干重、胞內(nèi)、胞外多糖隨培養(yǎng)時間的變化培養(yǎng)時間 (d) 3 5 7 9 11 13菌絲體干重(g/L) 胞外多糖(g/L) 胞內(nèi)多糖(g/L) （2）桑黃生長曲線和多糖積累曲線①根據(jù)表 ，繪制桑黃的生長曲線，如圖 。0 2 4 6 8 10 12 14培 養(yǎng) 時 間 d菌絲體干重g圖 桑黃菌和生長曲線②根據(jù)表 ，繪制桑黃多糖積累曲線，如圖 。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XXII 00 2 4 6 8 10 12 14培 養(yǎng) 時 間 d多糖質(zhì)量g 胞 外 多 糖 隨培 養(yǎng) 時 間 的變 化胞 內(nèi) 多 糖 隨培 養(yǎng) 時 間 的變 化圖 桑黃胞內(nèi)、胞外多糖的積累曲線（3）結(jié)果分析從圖 可以看出：液體培養(yǎng)的桑黃初期生長比較緩慢，從第 3 天開始，隨著發(fā)酵進程的不斷深入，菌絲體的生長越來越旺盛，到第 8 天，菌絲體產(chǎn)量達到最高峰，之后生長趨于穩(wěn)定，到第 10 天，桑黃生物量有所下降。也就是說，液體培養(yǎng)的桑黃第 1～2 天為遲滯期，第 3～7 天為對數(shù)生長期，第 8～10天為穩(wěn)定期，從第 11 天開始進入衰亡期。因此，在接種時，盡量接培養(yǎng)了5～7 天的桑黃菌種。結(jié)合圖 31 和圖 32，可以看出胞內(nèi)多糖的多少和菌絲體產(chǎn)量有著直接的關(guān)系，隨著菌絲體量而變化，到第 7 天時的胞內(nèi)多糖達到最大，以后則隨著菌絲體的減少也相應(yīng)的減少，但減少得更快一些，這主要是因為桑黃菌絲的自溶。胞外多糖也與菌絲體的量有密切的關(guān)系：培養(yǎng)前期，胞外多糖隨菌絲體的增加而增加，第 8 天以后雖然菌絲體的重量已經(jīng)穩(wěn)定，并逐漸進入衰亡期，但胞外多糖依然是增加的，這主要是因為菌絲體內(nèi)多糖的溶出，但這以后的增幅有限，而且不久開始下降。正是由于桑黃菌絲產(chǎn)量的大小可以反映多糖產(chǎn)量的高低，我們在優(yōu)化培養(yǎng)基實驗的過程中，可以用菌絲體的產(chǎn)量來評估多糖的產(chǎn)量。此外，為獲取胞內(nèi)多糖胞外多糖桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XXIII較高的菌絲及多糖產(chǎn)量，桑黃菌的發(fā)酵培養(yǎng)應(yīng)為 7 天為宜。 培養(yǎng)基初始 pH 值的篩選（1）試驗數(shù)據(jù)表 列出了不同初始 pH 值的培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干重的質(zhì)量。表 不同初始 pH 值對菌絲體產(chǎn)量的影響初始 pH 值 1 2 3 菌絲體干重(g/L)平均值 不同初始 pH 值與菌絲體干重的曲線見圖 33。圖 菌絲體隨培養(yǎng)基初始 pH 值的變化曲線圖（2）結(jié)果分析液體培養(yǎng)基作為菌絲體生活的外部環(huán)境，pH 值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝。圖 可以看出，可知桑黃菌在弱酸性培養(yǎng)液中生長較好，而在堿性培養(yǎng)液中很難生長；最適的 pH 在 ～ 之間。在 PDA 培養(yǎng)基中，自然 pH為 ～，固在配制 PDA 培養(yǎng)基時，自然 pH 即可。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XXIV 培養(yǎng)基碳源的篩選（1）實驗數(shù)據(jù)表中 列出了不同碳源的培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干重的質(zhì)量。表 不同碳源對菌絲體產(chǎn)量的影響碳源 葡萄糖 蔗糖 乳糖 可溶性淀粉 玉米粉1 2 3 菌絲體產(chǎn)量(g/L)平均值 不同碳源對菌絲體干重的影響圖見圖 。01234561 2 3 4 5碳 源菌絲體干重(g)圖 不同碳源對菌絲體干重的影響圖上圖中 5 分別代表葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和玉米粉。（2）結(jié)果分析碳元素是真菌最重要的營養(yǎng)，它不僅是碳水化合物和蛋白質(zhì)的基本組成元素，同時又是重要的能量來源。凡是可以作為微生物細胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質(zhì)，即稱為碳源。可作為微生物營養(yǎng)的碳源物質(zhì)種類極其廣泛，從簡單的無機物到復(fù)雜的有機含碳化合物。但不同的微生物利用碳源的能力不同。由表 可知，桑黃對碳的利用相當(dāng)廣泛，對單糖、寡糖、多糖均可利用。就實驗的 5 種碳源來講，玉米粉作為碳源時最有利于菌絲體的生長和多糖桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XXV的合成，葡萄糖次之。而且從經(jīng)濟上考慮，玉米粉比較廉價易得，因此，玉米粉可作為桑黃菌絲工業(yè)化液體發(fā)酵的廉價碳源。 培養(yǎng)基氮源的篩選（1）試驗數(shù)據(jù)表中 列出了不同氮源的培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干重的質(zhì)量。不同氮源對菌絲體干重的影響圖見圖 。表 不同氮源對菌絲體產(chǎn)量的影響氮源 土豆 蛋白胨 黃豆餅粉 牛肉膏 +酵母浸出汁 (NH4)2SO41 2 3 菌絲體產(chǎn)量(g/L) 平均值 012345671 2 3 4 5氮 源菌絲體干重(g)圖 不同氮源對菌絲體干重的影響圖上圖中 5 分別代表土豆、蛋白胨、黃豆餅粉、牛肉膏+酵母浸出汁和(NH 4)2SO4。（2）結(jié)果分析桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XXVI凡是構(gòu)成微生物細胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮元素來源的營養(yǎng)物質(zhì)，稱為氮源。細胞的干物質(zhì)中氮含量僅次于碳和氧。氮素是真菌合成蛋白質(zhì)、核酸的必要原料，對菌絲的生長發(fā)育至關(guān)重要。從表 可知，5 種氮源中，蛋白胨和黃豆餅粉作為氮源對桑黃菌絲生長都很好，但從工業(yè)化角度來說，選黃豆餅粉作為氮源較實際，因為黃豆餅粉比較廉價而且易得。 驗證培養(yǎng)基實驗數(shù)據(jù)（1）試驗數(shù)據(jù)優(yōu)化培養(yǎng)基及對照組中桑黃菌絲體的產(chǎn)量見表 。表 優(yōu)化培養(yǎng)基及其對照組中桑黃菌絲體的產(chǎn)量實驗 1 實驗 2 實驗 3 平均值優(yōu)化培養(yǎng)基菌絲體干重(g/L) 對照組菌絲體干重(g/L) （2）結(jié)果分析根據(jù)表 ，優(yōu)化后的培養(yǎng)基菌絲干重比對照組菌絲干重超出 倍，足以說明優(yōu)化培養(yǎng)基的高產(chǎn)的有效性。由于所用的實驗材料均為農(nóng)副產(chǎn)品，價格低廉、資源豐富，便于工業(yè)化。 多糖提取工藝數(shù)據(jù)及分析 乙醇濃度對多糖得率的影響（1）試驗數(shù)據(jù)根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算桑黃胞外多糖的得率：發(fā)酵液 100ml，收率=多糖產(chǎn)量/100 (ml) ，如表 表 胞外多糖收率數(shù)據(jù)記錄組別 1 2 3乙醇濃度（%） 75 85 95桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XXVII多糖 (g) 單位收率(g/ml) （2）結(jié)果分析通過表 數(shù)據(jù)表明，95%濃度的乙醇溶液粗多糖的析出量最多，單位%及 95%乙醇溶液的粗多糖的收率方差顯著性較小，而對 75%的乙醇溶液的粗多糖的收率方差顯著性較大。說明使用 85%的乙醇溶液進行粗多糖的收率與使用 95%的乙醇溶液進行粗多糖的收率接近。在工業(yè)化生產(chǎn)過程中醇沉使用的乙醇需要回收利用，回收的乙醇達到 85%濃度比達到 95%濃度要節(jié)省動力消耗，為工業(yè)化生產(chǎn)上使用回收的乙醇提供了理論依據(jù)。 桑黃胞內(nèi)多糖提取實驗（1）試驗數(shù)據(jù)根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算桑黃包內(nèi)多糖的產(chǎn)率：菌絲體 4g，產(chǎn)率=多糖產(chǎn)量/4 (g 多糖/g 菌絲體)表 蒸煮時間不同組別 1 2 3蒸煮時間（h） 1 2多糖產(chǎn)量(g) 單位產(chǎn)量(g/g) 粗多糖提取率% 表 蒸煮次數(shù)不同組別 4 5 6蒸煮次數(shù) 1 2 3多糖產(chǎn)量(g) 單位產(chǎn)量(g/g) 粗多糖提取率% 桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XXVIII表 固液比不同組別 7 8 9加水量（倍） 1: 1:10 1:多糖產(chǎn)量(g) 單位產(chǎn)量(g/g) 粗多糖提取率% （2）結(jié)果分析根據(jù)表 可知，隨著水煮時間的延長，多糖的提取率也隨之提高，并且差異比較顯著。根據(jù)表 可知，每次水煮 1h， 隨著水煮時間的延長，多糖的提取率也隨之提高，并且差異比較顯著。如果采用逆流式連續(xù)提取可能效果會更好，這在以后的工作中再詳細地研究。根據(jù)表 可知，隨著固液比的增大，多糖的提取率也隨之提高，并且差異比較顯著。但是固液比增大后期濃縮的能耗也會增大，在本試驗的條件下采用 1:10 比例較好。 超聲波處理時間對多糖收率的影響（1）試驗數(shù)據(jù)在超聲波處理時間的確定實驗中，5 組方案的桑黃多糖產(chǎn)率見表 ：表 不同超聲時間桑黃多糖產(chǎn)率組別 超聲處理時間（min）多糖（g） 得率（%）1 10 2 15 3 20 桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報告XXIX4 25 5 30 05101520251 2 3 4 5超 聲 波 處 理 時 間 （ min）多糖得率（%）系 列 1圖 超聲時間多桑黃多糖產(chǎn)率的影響（2）結(jié)果分析由圖 可以看出，在超聲處理時間小于 20min 時，桑黃多糖的產(chǎn)率隨時間的延長而增加，在超聲處理 25min 時，達到提取最大值，而后隨超聲時間延長，多糖提取率有所下降，這是由于超聲處理數(shù)分鐘，細胞破碎程度增大后，細胞內(nèi)部的多糖物質(zhì)開始向外擴散，多糖的提取率開始上升較快，達到最大值。但是超聲波具有較強的機械剪切作用，長時間作用會使多糖結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多糖提取率有所下降。另外，超聲時間過長，細胞進一步破碎，雜質(zhì)溶出，這也是多糖提取率有所下降的原因之一。因此確定本實驗超聲時間為 25min。 桑黃菌絲生長形態(tài)在平板上觀察桑黃菌絲體生長的形態(tài)，菌蓋半球形，表面淺黃線至深，有同心紋和環(huán)棱，初期有微細絨毛，后變光滑，稍龜裂，硬而木質(zhì)化，均邊緣銳或鈍