【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 各種培養(yǎng)基中菌絲體的干重。④此實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。菌絲體干重為三次實(shí)驗(yàn)的平均值。（8）優(yōu)化培養(yǎng)基驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)由以上實(shí)驗(yàn)可知：最優(yōu)碳源為玉米粉、最優(yōu)氮源為黃豆餅粉、最適 pH 在～ 之間。利用優(yōu)化得來(lái)的結(jié)果，按照表 配制培養(yǎng)基，分裝，在壓力為 、溫度為 121℃的情況下滅菌 20min，待冷卻后接種，并在溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為 130r/min 的條件下用搖床培養(yǎng) 7 天后，按照 中步驟操作測(cè)桑黃菌絲體的干重。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XVIII重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，桑黃菌絲體干重為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。與此同時(shí)，用 PDA 液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組，并重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。表 優(yōu)化培養(yǎng)基的配方品名 玉米粉 黃豆餅粉 KH2PO4 MgSO4 維生素 B1 維生素 B2 pH配比(g/100mL) 3 1 ～ 多糖提取工藝優(yōu)化 乙醇濃度對(duì)多糖收率的影響（1）培養(yǎng)液濃縮 將培養(yǎng)液定量，用反滲透膜濃縮為原體積的 1/2，濃縮壓力 。反滲透膜濃縮操作：接通電源，電源指示燈亮，打開工作泵，調(diào)節(jié)濃縮液調(diào)壓閥將壓力調(diào)節(jié)到 Mpa，開始工作。（2）向濃縮后的培養(yǎng)液加入原體積 3 倍的乙醇，產(chǎn)生灰白色沉淀，將上述提取液放入冷藏柜，在 4℃下靜置一夜。以發(fā)酵液中多糖含量為依據(jù)，改變乙醇的濃度，以確定最佳提取工藝。見表 。表 改變乙醇濃度組別 1 2 3乙醇濃度（%） 75 85 95（3）將上述提取液用離心機(jī)分離，3000r/min，離心 10min，得到桑黃多糖，離心得到上清液（乙醇）回收。（4）將離心所得沉淀（桑黃多糖）用冷凍干燥機(jī)中干燥，得到的產(chǎn)品用精密電子天平稱量，記錄數(shù)據(jù)。 胞內(nèi)多糖提取實(shí)驗(yàn)優(yōu)化采用單因素實(shí)驗(yàn)法，選擇影響提取多糖含量的 3 個(gè)主要因素煎煮時(shí)間、固液比和水煮次數(shù)，其他因素不變，稱取等量的干菌絲體粉末，每個(gè)因素 3 個(gè)水桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XIX平，以提取多糖的質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比分析，從而優(yōu)化得到菌絲體提取多糖的最佳工藝。步驟 ：（1）將分離出來(lái)的菌絲體放入恒溫干燥機(jī)中，在 60～65℃下干燥； 恒溫干燥機(jī)的操作：首先插上電源，打開開關(guān)，設(shè)定干燥的溫度，干燥菌絲體需要 60℃，同時(shí)設(shè)定溫度的上限 65℃，將預(yù)備干燥的菌絲體用器皿裝好，放入干燥箱中，關(guān)閉干燥箱門，按下接通按鈕，開始干燥。（2）干燥結(jié)束，將菌絲體研磨成粉狀，然后稱取 9 份等量的菌絲體粉末，進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。分別按照表 、表 和表 的設(shè)計(jì)進(jìn)行蒸煮實(shí)驗(yàn)。表 改變水煮時(shí)間組別 1 2 3水煮時(shí)間（h） 1 2表 改變水煮次數(shù)組別 4 5 6水煮次數(shù)（次） 1 2 3表 改變固液比組別 7 8 9固液比 1: 1:10 1:③將水煮液 3000r/min 離心 10min，分離得到上清液。④將上述上清液用反滲透膜濃縮為原體積的 1/2，操作同上。⑤下面用胞外多糖提取的方法提取菌絲體多糖并記錄數(shù)據(jù)及結(jié)果。 超聲波處理時(shí)間對(duì)多糖收率的影響本實(shí)驗(yàn)將除時(shí)間外的其他提取條件設(shè)置為料液比 1:10，超聲波提取溫度60℃，功率 400W。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XX（1） 稱取 5 份桑黃菌絲體粉末，每份 10g，置于燒杯中，編號(hào) 1～5，加入蒸餾水并加熱到 60℃。（2）將上述 5 組混合物進(jìn)行超聲波處理，時(shí)間分別為10min、15min、20min、25min、30min。（3）水煮 1h，冷卻后（4℃）分別加入 95%乙醇。（4）離心去除上清液，所的沉淀冷凍干燥并稱量。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XXI第 3 章 試驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析 桑黃菌絲液體培養(yǎng)工藝數(shù)據(jù)及分析 桑黃生長(zhǎng)曲線與桑黃多糖積累曲線的繪制（1）實(shí)驗(yàn)記錄表測(cè)定桑黃生長(zhǎng)曲線時(shí)，桑黃菌絲體干重以及胞內(nèi)外多糖隨培養(yǎng)時(shí)間的記錄表見表 31。表 桑黃菌絲體干重、胞內(nèi)、胞外多糖隨培養(yǎng)時(shí)間的變化培養(yǎng)時(shí)間 (d) 3 5 7 9 11 13菌絲體干重(g/L) 胞外多糖(g/L) 胞內(nèi)多糖(g/L) （2）桑黃生長(zhǎng)曲線和多糖積累曲線①根據(jù)表 ，繪制桑黃的生長(zhǎng)曲線，如圖 。0 2 4 6 8 10 12 14培 養(yǎng) 時(shí) 間 d菌絲體干重g圖 桑黃菌和生長(zhǎng)曲線②根據(jù)表 ，繪制桑黃多糖積累曲線，如圖 。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XXII 00 2 4 6 8 10 12 14培 養(yǎng) 時(shí) 間 d多糖質(zhì)量g 胞 外 多 糖 隨培 養(yǎng) 時(shí) 間 的變 化胞 內(nèi) 多 糖 隨培 養(yǎng) 時(shí) 間 的變 化圖 桑黃胞內(nèi)、胞外多糖的積累曲線（3）結(jié)果分析從圖 可以看出：液體培養(yǎng)的桑黃初期生長(zhǎng)比較緩慢，從第 3 天開始，隨著發(fā)酵進(jìn)程的不斷深入，菌絲體的生長(zhǎng)越來(lái)越旺盛，到第 8 天，菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高峰，之后生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，到第 10 天，桑黃生物量有所下降。也就是說(shuō)，液體培養(yǎng)的桑黃第 1～2 天為遲滯期，第 3～7 天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第 8～10天為穩(wěn)定期，從第 11 天開始進(jìn)入衰亡期。因此，在接種時(shí)，盡量接培養(yǎng)了5～7 天的桑黃菌種。結(jié)合圖 31 和圖 32，可以看出胞內(nèi)多糖的多少和菌絲體產(chǎn)量有著直接的關(guān)系，隨著菌絲體量而變化，到第 7 天時(shí)的胞內(nèi)多糖達(dá)到最大，以后則隨著菌絲體的減少也相應(yīng)的減少，但減少得更快一些，這主要是因?yàn)樯｜S菌絲的自溶。胞外多糖也與菌絲體的量有密切的關(guān)系：培養(yǎng)前期，胞外多糖隨菌絲體的增加而增加，第 8 天以后雖然菌絲體的重量已經(jīng)穩(wěn)定，并逐漸進(jìn)入衰亡期，但胞外多糖依然是增加的，這主要是因?yàn)榫z體內(nèi)多糖的溶出，但這以后的增幅有限，而且不久開始下降。正是由于桑黃菌絲產(chǎn)量的大小可以反映多糖產(chǎn)量的高低，我們?cè)趦?yōu)化培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，可以用菌絲體的產(chǎn)量來(lái)評(píng)估多糖的產(chǎn)量。此外，為獲取胞內(nèi)多糖胞外多糖桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XXIII較高的菌絲及多糖產(chǎn)量，桑黃菌的發(fā)酵培養(yǎng)應(yīng)為 7 天為宜。 培養(yǎng)基初始 pH 值的篩選（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)表 列出了不同初始 pH 值的培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干重的質(zhì)量。表 不同初始 pH 值對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響初始 pH 值 1 2 3 菌絲體干重(g/L)平均值 不同初始 pH 值與菌絲體干重的曲線見圖 33。圖 菌絲體隨培養(yǎng)基初始 pH 值的變化曲線圖（2）結(jié)果分析液體培養(yǎng)基作為菌絲體生活的外部環(huán)境，pH 值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝。圖 可以看出，可知桑黃菌在弱酸性培養(yǎng)液中生長(zhǎng)較好，而在堿性培養(yǎng)液中很難生長(zhǎng)；最適的 pH 在 ～ 之間。在 PDA 培養(yǎng)基中，自然 pH為 ～，固在配制 PDA 培養(yǎng)基時(shí)，自然 pH 即可。桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XXIV 培養(yǎng)基碳源的篩選（1）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表中 列出了不同碳源的培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干重的質(zhì)量。表 不同碳源對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響碳源 葡萄糖 蔗糖 乳糖 可溶性淀粉 玉米粉1 2 3 菌絲體產(chǎn)量(g/L)平均值 不同碳源對(duì)菌絲體干重的影響圖見圖 。01234561 2 3 4 5碳 源菌絲體干重(g)圖 不同碳源對(duì)菌絲體干重的影響圖上圖中 5 分別代表葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和玉米粉。（2）結(jié)果分析碳元素是真菌最重要的營(yíng)養(yǎng)，它不僅是碳水化合物和蛋白質(zhì)的基本組成元素，同時(shí)又是重要的能量來(lái)源。凡是可以作為微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳架來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，即稱為碳源。可作為微生物營(yíng)養(yǎng)的碳源物質(zhì)種類極其廣泛，從簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物到復(fù)雜的有機(jī)含碳化合物。但不同的微生物利用碳源的能力不同。由表 可知，桑黃對(duì)碳的利用相當(dāng)廣泛，對(duì)單糖、寡糖、多糖均可利用。就實(shí)驗(yàn)的 5 種碳源來(lái)講，玉米粉作為碳源時(shí)最有利于菌絲體的生長(zhǎng)和多糖桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XXV的合成，葡萄糖次之。而且從經(jīng)濟(jì)上考慮，玉米粉比較廉價(jià)易得，因此，玉米粉可作為桑黃菌絲工業(yè)化液體發(fā)酵的廉價(jià)碳源。 培養(yǎng)基氮源的篩選（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)表中 列出了不同氮源的培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干重的質(zhì)量。不同氮源對(duì)菌絲體干重的影響圖見圖 。表 不同氮源對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響氮源 土豆 蛋白胨 黃豆餅粉 牛肉膏 +酵母浸出汁 (NH4)2SO41 2 3 菌絲體產(chǎn)量(g/L) 平均值 012345671 2 3 4 5氮 源菌絲體干重(g)圖 不同氮源對(duì)菌絲體干重的影響圖上圖中 5 分別代表土豆、蛋白胨、黃豆餅粉、牛肉膏+酵母浸出汁和(NH 4)2SO4。（2）結(jié)果分析桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XXVI凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮元素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，稱為氮源。細(xì)胞的干物質(zhì)中氮含量?jī)H次于碳和氧。氮素是真菌合成蛋白質(zhì)、核酸的必要原料，對(duì)菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。從表 可知，5 種氮源中，蛋白胨和黃豆餅粉作為氮源對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)都很好，但從工業(yè)化角度來(lái)說(shuō)，選黃豆餅粉作為氮源較實(shí)際，因?yàn)辄S豆餅粉比較廉價(jià)而且易得。 驗(yàn)證培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)優(yōu)化培養(yǎng)基及對(duì)照組中桑黃菌絲體的產(chǎn)量見表 。表 優(yōu)化培養(yǎng)基及其對(duì)照組中桑黃菌絲體的產(chǎn)量實(shí)驗(yàn) 1 實(shí)驗(yàn) 2 實(shí)驗(yàn) 3 平均值優(yōu)化培養(yǎng)基菌絲體干重(g/L) 對(duì)照組菌絲體干重(g/L) （2）結(jié)果分析根據(jù)表 ，優(yōu)化后的培養(yǎng)基菌絲干重比對(duì)照組菌絲干重超出 倍，足以說(shuō)明優(yōu)化培養(yǎng)基的高產(chǎn)的有效性。由于所用的實(shí)驗(yàn)材料均為農(nóng)副產(chǎn)品，價(jià)格低廉、資源豐富，便于工業(yè)化。 多糖提取工藝數(shù)據(jù)及分析 乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算桑黃胞外多糖的得率：發(fā)酵液 100ml，收率=多糖產(chǎn)量/100 (ml) ，如表 表 胞外多糖收率數(shù)據(jù)記錄組別 1 2 3乙醇濃度（%） 75 85 95桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XXVII多糖 (g) 單位收率(g/ml) （2）結(jié)果分析通過(guò)表 數(shù)據(jù)表明，95%濃度的乙醇溶液粗多糖的析出量最多，單位%及 95%乙醇溶液的粗多糖的收率方差顯著性較小，而對(duì) 75%的乙醇溶液的粗多糖的收率方差顯著性較大。說(shuō)明使用 85%的乙醇溶液進(jìn)行粗多糖的收率與使用 95%的乙醇溶液進(jìn)行粗多糖的收率接近。在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中醇沉使用的乙醇需要回收利用，回收的乙醇達(dá)到 85%濃度比達(dá)到 95%濃度要節(jié)省動(dòng)力消耗，為工業(yè)化生產(chǎn)上使用回收的乙醇提供了理論依據(jù)。 桑黃胞內(nèi)多糖提取實(shí)驗(yàn)（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算桑黃包內(nèi)多糖的產(chǎn)率：菌絲體 4g，產(chǎn)率=多糖產(chǎn)量/4 (g 多糖/g 菌絲體)表 蒸煮時(shí)間不同組別 1 2 3蒸煮時(shí)間（h） 1 2多糖產(chǎn)量(g) 單位產(chǎn)量(g/g) 粗多糖提取率% 表 蒸煮次數(shù)不同組別 4 5 6蒸煮次數(shù) 1 2 3多糖產(chǎn)量(g) 單位產(chǎn)量(g/g) 粗多糖提取率% 桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XXVIII表 固液比不同組別 7 8 9加水量（倍） 1: 1:10 1:多糖產(chǎn)量(g) 單位產(chǎn)量(g/g) 粗多糖提取率% （2）結(jié)果分析根據(jù)表 可知，隨著水煮時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率也隨之提高，并且差異比較顯著。根據(jù)表 可知，每次水煮 1h， 隨著水煮時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率也隨之提高，并且差異比較顯著。如果采用逆流式連續(xù)提取可能效果會(huì)更好，這在以后的工作中再詳細(xì)地研究。根據(jù)表 可知，隨著固液比的增大，多糖的提取率也隨之提高，并且差異比較顯著。但是固液比增大后期濃縮的能耗也會(huì)增大，在本試驗(yàn)的條件下采用 1:10 比例較好。 超聲波處理時(shí)間對(duì)多糖收率的影響（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)在超聲波處理時(shí)間的確定實(shí)驗(yàn)中，5 組方案的桑黃多糖產(chǎn)率見表 ：表 不同超聲時(shí)間桑黃多糖產(chǎn)率組別 超聲處理時(shí)間（min）多糖（g） 得率（%）1 10 2 15 3 20 桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告XXIX4 25 5 30 05101520251 2 3 4 5超 聲 波 處 理 時(shí) 間 （ min）多糖得率（%）系 列 1圖 超聲時(shí)間多桑黃多糖產(chǎn)率的影響（2）結(jié)果分析由圖 可以看出，在超聲處理時(shí)間小于 20min 時(shí)，桑黃多糖的產(chǎn)率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在超聲處理 25min 時(shí)，達(dá)到提取最大值，而后隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提取率有所下降，這是由于超聲處理數(shù)分鐘，細(xì)胞破碎程度增大后，細(xì)胞內(nèi)部的多糖物質(zhì)開始向外擴(kuò)散，多糖的提取率開始上升較快，達(dá)到最大值。但是超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)使多糖結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多糖提取率有所下降。另外，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)一步破碎，雜質(zhì)溶出，這也是多糖提取率有所下降的原因之一。因此確定本實(shí)驗(yàn)超聲時(shí)間為 25min。 桑黃菌絲生長(zhǎng)形態(tài)在平板上觀察桑黃菌絲體生長(zhǎng)的形態(tài)，菌蓋半球形，表面淺黃線至深，有同心紋和環(huán)棱，初期有微細(xì)絨毛，后變光滑，稍龜裂，硬而木質(zhì)化，均邊緣銳或鈍