【文章內容簡介】 術還不成熟，尚未將其充分轉化為更??1合理更有價值的資源，大量的黃酒糟僅作低價飼料，甚至可能會霉爛污染環(huán)境。黃酒糟營養(yǎng)價值豐富，研究其蛋白提取工藝不但能夠降低黃酒企業(yè)的生產(chǎn)成本，還能有效地減少環(huán)境污染 。??12黃酒糟蛋白提取工藝研究2因此研究黃酒糟蛋白質的最佳提取工藝對其綜合利用具有重要的意義。在黃酒糟的研究開發(fā)利用過程中本著變廢為寶的角度，需要開創(chuàng)一條既可減少環(huán)境污染，又可以節(jié)約資源、降低生產(chǎn)成本的新思路。同時，因為黃酒糟、白酒糟和啤酒糟中的組成含量也比較相似，這樣深入對黃酒糟蛋白的研究開發(fā)也就為其他酒糟的開發(fā)利用提供了可參考的重要依據(jù) 。??13 黃酒糟蛋白提取工藝的可行性分析 黃酒糟蛋白屬于植物蛋白的一種，植物蛋白的提取方法有很多，最常用的是酸法、堿溶酸沉法以及酶法。傳統(tǒng)方法是以酸法提取為主，但由于酸法水解溫度較高，一般在 100℃以上。原料中的碳水化合物易脫水，含硫氨基酸會分解產(chǎn)生含硫化合物，使產(chǎn)品具有一股臭味。而且水解程度難以控制，活性肽含量低，水解產(chǎn)物中鹽分含量較高。堿溶酸沉法，是一種簡單易行的提取方法，比如在大豆蛋白等分離提取中就有著十分廣泛的應用。但在高堿性條件下，堿水解會引起蛋白質的變性和水解，氨基酸的結構會遭到破壞，蛋白質的營養(yǎng)價值也隨之降低，同時也增加了非蛋白成分，使得蛋白難以提取。酶法則是通過酶水解植物蛋白將其中的蛋白質分解成氨基酸和分子量較小的多肽而提取出來。酶法水解反應條件溫和、副反應較少、有害物質產(chǎn)生少、水解程度也容易控制，特別是對營養(yǎng)物質成分的保留上，具有不可比擬的優(yōu)點。所以說酶法提取蛋白質是植物蛋白提取乃至未來食品與生化工藝發(fā)展方向的指標 。??3 堿性內切蛋白酶是由造育的地衣芽孢桿菌發(fā)酵而得，主要成分為枯草桿菌蛋白酶，是一種內肽酶，催化部位為絲氨酸，分子量約為 27300。它能水解蛋白質分子肽鏈生成多肽或氨基酸，具有較強的分解蛋白質的能力。在堿性環(huán)境下(pH 為 9~12)催化蛋白質，主要生成物質為肽類及氨基酸。其最適溫度范圍為 40~55℃，添加量一般為500~2500u/g。堿性內切蛋白酶水解酒糟，因其適合的作用條件是在堿性環(huán)境下，這更有利于堿溶性蛋白谷蛋白等的溶解。因為酒糟蛋白原本就可以通過堿提的方法制得，在堿酶的高提取率中，部分應歸功于堿提的作用。堿性內切蛋白酶對天然底物的專一性甚強，有終端疏水性氨基酸的專一性，主要裂解疏水性氨基酸的終端如：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等，而疏水性氨基酸在終端比在肽鏈間的苦味小 。除此之外，由??14于堿性內切蛋白酶是微生物酶，來源廣、成本低、適合工業(yè)化生產(chǎn)，是比較理想的工業(yè)用酶。因此，綜上所述考慮到蛋白質的提取效率和避免蛋白水解液的苦味性，本課題決定采用堿性蛋白酶研究黃酒糟蛋白的酶法提取工藝。 本課題的研究內容 本課題是以黃酒糟為原料，研究黃酒糟蛋白的酶法提取工藝，旨在充分開發(fā)利用其中含量最大的水不溶性谷蛋白，提高蛋白質的提取效率。以此極大地緩解我國蛋白資黃酒糟蛋白提取工藝研究3源匱乏的嚴峻現(xiàn)狀，并可有效地發(fā)展經(jīng)濟，實現(xiàn)食品工業(yè)、化工產(chǎn)業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等方面的可持續(xù)發(fā)展。2 試驗材料與方法 試驗材料 試驗原料表 1 試驗原料原料名稱 采購時間 產(chǎn)地黃酒糟 2022 年 4 月 河南省南陽市 試驗試劑表 2 試驗所用主要試劑試劑 生產(chǎn)廠家（產(chǎn)地）纖維素酶 15000u/g堿性內切蛋白酶 202200u/g混合指示劑濃硫酸上海撫生實業(yè)有限公司河南金源生物科技有限公司天津市科密歐化學試劑有限公司天津致遠化學試劑有限公司過氧化氫 天津致遠化學試劑有限公司氫氧化鈉硫酸鉀天津市德恩化學試劑有限公司國藥集團化學試劑有限公司硼酸 北京化學試劑公司鹽酸 中平能化集團開封東大化工有限公司CuSO45H2O 北京化學試劑公司牛血清蛋白 北京化學試劑公司黃酒糟蛋白提取工藝研究4 試驗儀器表 3 試驗所用主要儀器刻度試管，燒杯，容量瓶，三角瓶，移液管，天平等試驗室常用玻璃儀器。 試驗方法 原材料預處理及工藝流程 （1）原材料預處理 ? 黃酒糟粉末的制備黃酒糟經(jīng)干燥處理后用高轉速粉碎機粉碎，然后過 60 目篩。 ? 水洗除雜準確稱取 黃酒糟粉末，按 1:6 的比例加水，攪拌使黃酒糟粉末均勻分散于水中，在 60℃的溫度下水浴振蕩 30min，之后以 4000r/min 的速度離心 5min，棄上清液。 ? 纖維素酶水解經(jīng)過水洗之后，黃酒糟中還有一些粗纖維等不溶性物質未能有效除去，只能通過酸法或酶法來降解。因此還需要用纖維素酶將纖維素降解，以便解除蛋白質與纖維素的結合，釋放蛋白質，提高蛋白質的提取率。準確稱取 水洗除雜后的黃酒糟濕基，按照 1:8 的比例加水，在 50℃水浴鍋內保溫，待錐形瓶內料液溫度達到 50℃后，調整 pH 值到 5(采用 1mol/L 的 NaOH 來調整) 。按照 28u/g 的酶量添加纖維素酶，水浴振蕩 30min 結束；在反應過程中不斷加堿，維名稱 型號 生產(chǎn)廠家電子天平 BS210S 北京賽多利斯天平有限公司高速萬能粉碎機 FW100 北京中興偉業(yè)儀器有限公司電熱恒溫振蕩水槽 SHC28 鄭州杜甫儀器廠電熱恒溫干燥箱 CS101A 北京市永光明醫(yī)療儀器廠電熱恒溫水浴鍋 HHS 鞏義設備有限公司721 分光光度計 721 上海精密儀器廠低溫高速離心機 TDL40B 北京中興偉業(yè)儀器有限公司自動純水蒸餾器 SZ96 上海亞榮生化儀器廠氣流烘干器 KQB 長城科工貿有限公司精密 pH 計 pH S25 上海精科雷磁黃酒糟蛋白提取工藝研究5持反應體系 pH 在設定值的177。 之內。反應結束后在沸水浴中加熱 15min 進行酶滅活處理。以 4000r/min 的速度離心 10min，棄上清液收集沉淀物。最后干燥處理。 （2）工藝流程 準確稱重 g 處理后的黃酒糟→加水→ 調整適當 pH 值和溫度→酶解→滅酶(100℃，15 min)→ 離心(4000r/min，10 min)→收集上清液→紫外分光光度法測定吸光值→根據(jù)吸光值計算蛋白質含量。 蛋白質的標準曲線制作由于酪氨酸、色氨酸殘基和苯丙氨酸所含有的苯環(huán)具有共軛雙鍵 ，使得蛋白質??15分子具有吸收紫外光的性質，其最大吸收峰位于 280nm 附近（不同的蛋白質吸收波長略有差別）。在最大吸收峰處，吸光度與蛋白質的含量成正比，其關系服從朗伯比耳定律。利用在一定的波長下，蛋白質溶液的光吸收值與其濃度的正比關系，則可以測定其中的蛋白質的含量 。該測定法具有簡單靈敏快速、高選擇性、干擾易消除、不??15消耗樣品，且穩(wěn)定性好、不干擾測定等優(yōu)點 。??16測定蛋白質溶液在 280nm 處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。許多蛋白質在一定濃度和一定波長下的光吸收值有文獻數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準確地計算蛋白質濃度。若查不到待測蛋白質的光吸收值，則可選用一種與待測蛋白質的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質作為標準蛋白質，用標準曲線法進行測定。標準蛋白質溶液配制的濃度為 。常用的標準蛋白質為牛血清蛋白（BSA）。準確稱取 25mg 牛血清蛋白粉末，于小燒杯中溶解，搖勻后加入到 25mL 的容量瓶中，配置成 1mg/mL 的牛血清蛋白標準溶液。將得到的標準牛血清蛋白標準溶液精密吸取 ，，， 分別于七個潔凈的 4mL刻度試管中，然后向每個刻度試管中各加入蒸餾水， ， ， ， ， 充分振蕩后靜置 6min，在280nm 處測吸光度。以蛋白質濃度和對應的吸光值為對應坐標，繪制標準曲線。 單因素試驗 （1）加酶量對蛋白提取率的影響 準確稱取經(jīng)處理過的黃酒糟 ，按照 1:8 的料水比加水，于 50℃水浴鍋中保溫，而后調整 pH 值到 11(采用 1mol/L 的 NaOH 調整)。按照500u/g、1000u/g、1500u/g、2022u/g、2500u/g 的加酶量添加堿性內切蛋白酶，水浴振蕩 2h，在反應過程中不斷加酸或堿，維持反應液中 pH 在設定值 11177。 范圍內。反應結束后在沸水浴中加熱 15min 進行酶滅活處理，然后調整 pH 至 7，以 4000r/min 的速度離心 10min，收集上清液 。用紫外分光光度法測定上清液的吸光值，進而算得蛋白??3質含量，最后計算蛋白提取率。黃酒糟蛋白提取工藝研究6 （2）pH 對蛋白提取率的影響準確稱取經(jīng)處理過的黃酒糟 ，按照 1:8 的料水比加水，于 50℃的水浴鍋內保溫，而后調整 pH 值為 112。按照 2022u/g 的加酶量添加堿性內切蛋白酶，水浴振蕩 2h，在