【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 質(zhì)、多糖及多種維生素和礦物質(zhì)，具有極高的食用價(jià)值。榛蘑還有著重要的藥用價(jià)值，其多糖成分具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、降血糖等藥理作用，在食品行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景，所以榛蘑多糖引起了許多人的關(guān)注，不少科研工作者開始研究榛蘑多糖的提取純化及各種理化性質(zhì)。目前榛蘑多糖的提取多采用傳統(tǒng)水提法，提取率偏低，所以本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)行傳統(tǒng)水提法、超聲波法、酶法和超聲波—酶聯(lián)合提取法提取榛蘑多糖，從而得到最佳工藝條件，提高榛蘑多糖的提取率，為創(chuàng)建高效、經(jīng)濟(jì)的多糖提取工藝提供參考，為今后榛蘑多糖精深產(chǎn)品加工提供一定的理論和技術(shù)支持。 榛蘑粉傳統(tǒng)水提 超聲波法 超聲波酶聯(lián)合法 酶法 加酶率酶解溫度酶解時(shí)間 PH 料液比超聲功率超聲溫度超聲時(shí)間 回流浸提 超聲處理 濃縮除蛋白離心醇沉榛蘑多糖計(jì)算提取率2 材料和方法 試驗(yàn)器材 試驗(yàn)儀器超聲波細(xì)胞清洗器KQ500DE 昆山超聲波儀器有限公司電熱恒溫水浴鍋DKS12上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司臺(tái)式低速離心機(jī)TDL5W湖南星科科學(xué)儀器有限公司恒溫水浴搖床HZSHA哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司循環(huán)水多用真空泵SHB3鄭州杜甫儀器廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE 52A上海亞榮生化儀器廠中草藥粉碎機(jī)FW135天津市泰斯特儀器有限公司可見光分光光度計(jì)722S上海精密科學(xué)儀器有限公司臺(tái)秤YP2001N上海精密科學(xué)儀器有限公司分析天平JA2003上海良品儀器儀表有限公司pH計(jì)PB10Sartorius有限公司電冰箱BCD215KSHaier有限公司 試驗(yàn)材料榛蘑購于家樂福超市纖維素酶購于美國Sigma公司苯酚分析純天津市瑞金特化學(xué)試劑有限公司濃硫酸分析純北京化工廠正丁醇分析純天津市天力化學(xué)試劑有限公司鹽酸分析純北京化工廠氫氧化鈉分析純天津市天力化學(xué)試劑有限公司無水乙醇分析純天津市天力化學(xué)試劑有限公司三氯甲烷分析純天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠 試驗(yàn)方法 將榛蘑洗凈、晾曬后，置于烘箱中，80℃下恒溫烘干后用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，得到榛蘑粉。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚—硫酸比色法測(cè)定多糖含量[24]。 g，加水定容至100mL，得到質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，、、 mL，分別置于10 mL容量瓶中，補(bǔ)加蒸餾水至2 mL，加入5%苯酚1 mL，混合均勻后快速加入98%濃硫酸7 mL，搖勻后室溫放置30 min，在波長490nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)。以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 根據(jù)邵信儒、孫海濤等人用熱水浸提法提取山榛蘑多糖得到的最佳工藝條件， 裝瓶備用。加入25ml蒸餾水，在95℃下回流浸提5h，回流結(jié)束后收集濾液； 相同條件下，再將濾渣洗入圓底燒瓶二次浸提， 浸提3次后，合并濾液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮（原料重：濃縮液=1:2） ，向濃縮液內(nèi)加入Sevag試劑除蛋白，按照濾液體積的1/4量加入Sevag試劑（氯仿:丁醇=4:1），直到?jīng)]有乳白色變性蛋白質(zhì)析出后，在150r/min下振蕩20min，4000r/min下離心10min，取上清液，加入3倍體積的95%乙醇沉淀多糖，再離心10min，將得到的沉淀用無水乙醇洗滌，干燥，得到榛蘑多糖。 ，定容至100 mL 后準(zhǔn)確吸取200 μL 于10 mL 容量瓶中，補(bǔ)加蒸餾水至2 mL，加入5%苯酚1 mL，混合均勻后快速加入98%濃硫酸7 mL，搖勻后室溫放置30 min，以不含樣品的溶液作為空白，于490 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程可計(jì)算出相應(yīng)的多糖質(zhì)量濃度。同時(shí), 可根據(jù)多糖得率公式計(jì)算出榛蘑多糖的得率： 多糖得率(%)=(50 V C f W2 /W3 W1 )100%式中: W1：稱取榛蘑粉的質(zhì)量( g ) W2：由W1 提取的榛蘑多糖的質(zhì)量( g ) W3：從W2 中稱取的用于分析測(cè)定的榛蘑多糖質(zhì)量( g ) V：溶解W3 定容后的體積( L ) f ：多糖的校正系數(shù), f= C：由回歸方程計(jì)算所得多糖的質(zhì)量濃度( g/L )。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到傳統(tǒng)水提法的多糖得率。 ，按一定料液比加入蒸餾水，置于超聲波清洗機(jī)中于一定溫度下作用一定時(shí)間，得到的提取液抽濾，向?yàn)V液內(nèi)加入Sevag試劑除蛋白，在 150r/min下振蕩20min, 離心10min，取上清液，加入3倍體積的95%乙醇沉淀多糖，再離心10min，將得到的沉淀用無水乙醇洗滌，干燥，得到榛蘑多糖。，每個(gè)處理重復(fù)3 次。分別對(duì)料液比、超聲溫度、超聲波功率、超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)[26].（1）料液比對(duì)榛蘑多糖得率的影響 在超聲溫度60℃，超聲波功率250W，超聲30min的條件下，分別配制料液比為1:1:31:1:41:50，提取多糖，計(jì)算得率。（2）超聲時(shí)間對(duì)榛蘑多糖提取率的影響 在超聲波功率250W，料液比1:40，超聲溫度60℃的條件下，分別超聲50min，提取多糖，計(jì)算得率。（3）超聲波功率對(duì)榛蘑多糖提取率的影響 在料液比1:40，超聲溫度60℃，超聲30min的條件下，分別設(shè)定超聲波功率為200、250、300、350、400W，提取多糖，計(jì)算得率。（4）超聲溫度對(duì)榛蘑多糖提取率的影響 在超聲波功率250W，料液比1:40，超聲30min的條件下，分別設(shè)超聲溫度為50、60、70、80℃，提取多糖，計(jì)算得率。以上每個(gè)處理均重復(fù)3 次。，選用正交表L9(34)研究超聲波提取榛蘑多糖的最佳條件 超聲波法提取榛蘑多糖正交因素水平表L9(34)水平因素A料液比B時(shí)間/minC功率/WD溫度/℃1 2 3 ，根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件，提取多糖，重復(fù)3次，得到最佳條件下的多糖得率。與正交試驗(yàn)中各條件下得到的得率比較，觀察該值是否最高。 超聲波—酶法聯(lián)合提取榛蘑多糖 ，按超聲波法提取榛蘑多糖正交試驗(yàn)得到的最佳料液比加入一定量的水，再向溶液中加入一定量的纖維素酶，調(diào)節(jié)溶液的pH為某一固定的值，并在一定溫度下水浴一定時(shí)間后，進(jìn)行超聲處理，其中超聲的功率、時(shí)間、溫度參照超聲波法提取榛蘑多糖得到的最佳工藝條件，對(duì)得到的提取液抽濾，向?yàn)V液內(nèi)加入Sevag試劑除蛋白，在150r/min下振蕩20min, 離心10min，取上清液，加入3倍體積的95%乙醇沉淀多糖，再離心10min，將得到的沉淀用無水乙醇洗滌，干燥，得到榛蘑多糖。[27]。(1)加酶率對(duì)榛蘑多糖得率的影響 在溫度為50℃、pH ，酶解時(shí)間為90 min 條件下，%、%、%、%、%，再經(jīng)超聲處理提取多糖，計(jì)算得率。（2）酶解時(shí)間對(duì)榛蘑多糖得率的影響 %，溫度為50℃，pH ，分別酶解60、90、1150 min，再經(jīng)超聲處理提取多糖，計(jì)算得率。（3）酶解溫度對(duì)榛蘑多糖得率的影響 ，%，酶解時(shí)間為90 min 條件下，分別設(shè)酶解溫度為450、560℃，再經(jīng)超聲處理提取多糖，計(jì)算得率。（4）pH對(duì)榛蘑多糖得率的影響 在50℃，%，酶解時(shí)間為90 min 的條件下，、 ，再經(jīng)超聲處理進(jìn)行多糖提取，計(jì)算得率。以上每個(gè)處理均重復(fù)3 次。，選用正交表L9(34)研究超聲波—酶法聯(lián)合提取榛蘑多糖的最佳條件[28]超聲波酶法聯(lián)合法提取榛蘑多糖正交因素水平表L9(34)水平因素A加酶率/%B時(shí)間/minC溫度/℃DpH1 2 3 —酶法聯(lián)合提取榛蘑多糖最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn) ，根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件進(jìn)行酶解，再經(jīng)超聲波處理后得到提取液，重復(fù)3次，得到最佳條件下的多糖得率。與正交試驗(yàn)中各條件下得到的得率比較，觀察該值是否最高。 根據(jù)超聲波—酶法最佳工藝條件中的酶解條件，只進(jìn)行酶解，提取液不再用超聲波處理，進(jìn)行抽濾、除蛋白、離心、醇沉等操作后，得到榛蘑多糖。試驗(yàn)重復(fù)三次，得到酶法提取榛蘑多糖的得率。3 結(jié)果與分析 將葡萄糖配制成不同濃度的溶液，采用苯酚硫酸法測(cè)定其在490nm處的吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制曲線，得到圖31 圖31葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葡萄糖濃度在0μg/mL30μg/mL區(qū)間，呈線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為 ?；貧w方程為：y = ，R2= x為葡