【文章內容簡介】 vered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus. Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is parable with the control medium tissue culture in the African Violet No BAP BAP reduced to mg. l1 No NAA Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation Poor shoot development and no roots NAA reduced to mg. l1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant NAA increased to mg. l1 Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus No MS salts No sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced to g. l1 Some root growth but reduced development of shoots MS salts increased to g. l1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus. 培養(yǎng)材料的支持物 瓊脂 (agar) ? 是由海藻中提取的一種高分子碳水化合物，本身不提供營養(yǎng) , 但卻是最好的固化劑。 ? 能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至 40℃ 凝固為固體狀凝膠。 ? 用量在 6— 10g/L之間。若濃度太高，培養(yǎng)基會變硬，營養(yǎng)物質難以擴散到組織中 。若濃度過低，凝固性不好。 ? 凝固能力與高壓滅菌的溫度、時間、 pH值等有關，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解。時間過久，瓊脂也會喪失凝固能力。 ? 優(yōu)點 :操作簡便，通氣問題易于解決，便于觀察。 ? 缺點：培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用；同時排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產生毒害作用。市售的瓊脂幾乎都含有雜質，因此，在研究植物組織或細胞的營養(yǎng)問題時，則應避免使用瓊脂。 ? 其他 有玻璃纖維、濾紙橋、海綿、脫脂棉、卡拉膠等，總的要求是排出的有害物質對培養(yǎng)材料沒有影響或影響較小。 抗生物質 ? 抗生物質有青霉素 、 鏈霉素 、 慶大霉素等 ， 用量在 5— 20mg/L之間 。 ? 添加抗生物質可防止菌類污染 ， 減少培養(yǎng)中材料的損失 ， 尤其是快速繁殖中 。 ? 對于剛感染的組織材料 ， 可向培養(yǎng)基中注入 5%—10%的抗菌素 。 可兩種抗生素混用 。 ? 但是抗生素對植物組織的生長也有抑制作用 。 活性炭 ? 活性炭為木炭粉碎加工形成的粉沫結構，它結構疏松，孔隙大，吸水力強，有 很強的吸附作用 。 ? 顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。 ? 溫度低吸附力強，溫度高吸附力減弱，甚至解吸附。 ? 通常使用濃度為 — l0g／ L。 ? 它可以吸附非極性物質和色素等大分子物質，包括瓊脂中所含的雜質，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質等。 活性炭的應用 ? 莖尖初代培養(yǎng)，加入適量活性炭，可以吸附外植體產生的致死性褐化物；活性炭可明顯促進新梢的形成和伸長，但其作用一般為 %— %，不能超過 %。 ? 活性炭在 生根時 有明顯的促進作用，其機理一般認為 活性炭通過減弱光照保護了 IAA，從而間接促進了根的生長，由于根的生長加快，吸收能力增強，反過來又促進莖、葉的生長。 ? 活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用，如在葡萄胚珠培養(yǎng)時向培養(yǎng)基加入 %的活性炭，可減少組織變褐和培養(yǎng)基變色，產生較少的愈傷組織。 ? 活性炭具有副作用 ， 極少量的活性炭可以完全吸附培養(yǎng)基中的調節(jié)物質 。 大量的活性炭加入 會削弱瓊脂的凝固能力 。 因此 ， 在使用時要有 量 的意識 ， 使活性炭發(fā)揮其積極作用 。 培養(yǎng)基的選擇 ? 由一種已 被廣泛使用的基本培養(yǎng)基 (如 Ms培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基 )開始。 對這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動 之后，即有可能得到一種能滿足實驗需要的 新培養(yǎng)基 ，選擇最佳培養(yǎng)基。 ? 常用試驗方法主要有 單因子試驗 、 多因子試驗 及廣譜實驗 等。 單因子試驗 ? 單因子試驗： 培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，只變動一個因子，可以找出這一因子對試驗的影響和影響的程度。 ? 例如： Ms基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動 NAA用量 ,觀察對某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個因素的試驗就是單因子試驗。 ? 必需 設置對照組與試驗組 ，試驗組可以有一組或幾組，對照組也可能有一組以上。對照組與試驗組中的試驗個體，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。 ? 試驗中各處理都要設 有一定的重復 ，隨試驗規(guī)模和要求不同，大多每個項目要有 4— 10瓶，每瓶至少 3塊培養(yǎng)物或 3叢小幼苗。 2種激素 5種濃度的實驗組合 6BA mg/L） 0 5 10 NAA 0 1 2 3 4 5 (mg/L) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 對培養(yǎng)基中兩個或兩個以上因素進行研究的試驗稱為 多因子實驗 ， 各個因子的每個水平相互搭配，構成了所有可能的處理組合， 如研究 NAA和 6— BA的最佳濃度組合，每個因子各設 5個濃度水平 (0， ， ， 5， 10mg／ L)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構成了一個具有 25項處理的試驗。 多因子試驗 廣譜實驗法 ? 廣譜實驗法中，把培養(yǎng)基中所有組分分為 4大類：無機鹽 、 有機營養(yǎng)物質 (蔗糖、氨基酸和肌醇等 )、生長素 、 細胞分裂素 。 ? 對每一類物質選定低 (L)、中 (M)、和高 (H)3個濃度。 4類物質各 3種濃度的自由組合即構成了一項包括 81個處理的實驗。 ? 81個處理中，最好的一個可用 4個字母表示。例如，一個包含中等濃度無機鹽，低等濃度生長素、中等濃度細胞分裂素和高等濃度有機營養(yǎng)物質的處理即可表示為 MLMH。 ? 再試用不同類型的生長素和細胞分裂素，即可找到最佳配方。 培養(yǎng)基的制備 母液的配制和保存 ? 為簡便起見，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂 母液是欲配制液的濃縮液 ，一般母液配成比所需濃度高 10100倍。 ? 母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。 ? 配制時注意一些離子之間易發(fā)生 沉淀 ，如 Ca2+和S042－ ， Ca2+、 Mg2+和 PO43 一起溶解后，會產生沉淀，一定要 充分溶解 再放入母液中。 ? 配制母液時要用蒸餾水或重蒸餾水。 ? 藥品應選取 等級較高的化學純或分析純 。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。 ? 一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱內低溫保存，用時再按比例稀釋。 母液的配制方法： ? 單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用 a:b表示，即每 b毫升溶液中含有 a毫克溶質。 ? 混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后，每一類混合在一起，定容到一定體積，配成混合母液。 ? 應將各種成分記在紙上，配制培養(yǎng)液時，加進一個，劃掉一個，確保準確。 ? 在裝有培養(yǎng)基的各類玻璃器皿上寫上標記。 培養(yǎng)基的滅菌 ? 方法： 高壓蒸汽滅菌：固體培養(yǎng)基 過濾滅菌法：液體培養(yǎng)基 ? 高壓蒸汽滅菌： ? 滅菌鍋要留有一定空間，便于蒸汽回流。 ? 保壓時間要嚴格，過長會破壞培養(yǎng)基中的化學物質。 ? 在 15～ 40min. 植物材料的清洗和滅菌 ? 從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物，會造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理。 第一步：清洗。 除去材料不用部分，將需要的部分仔細洗干凈，可用適當?shù)乃⒆铀⑾?。把材料切割成適當大小，流水沖洗，沖洗時間視材料清潔程度而異。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。 ? 可加入 洗衣粉 清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質性的物質，便于滅菌液的直接接觸。最理想的清洗物質是表面活性物質 — 吐溫 。 第二步：對材料表面浸潤滅菌 ? 在超凈臺或接種箱內完成，用 70%酒精浸 10～ 30s。 ? 酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，但其穿透力強，易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花蕾等，以及主要取用內部的材料，則可只用 70%酒精處理稍長的時間。 第三步：用滅菌劑處理 表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取 1— 2種使用。 滅菌劑