【正文】 第三篇 植物細(xì)胞工程 ? 植物組織培養(yǎng) ? 植物的快速繁殖 ? 單倍體誘導(dǎo)與單倍體育種 ? 植物胚胎培養(yǎng) ? 體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工種子 ? 植物原生質(zhì)體融合技術(shù) ? 植物染色體工程 ? 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù) 第 11章 植物組織培養(yǎng) ? 植物組織培養(yǎng)概念 ? 發(fā)展歷史 ? 組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ) ? 植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基 植物組織培養(yǎng)概念 ? 定義：在含有營養(yǎng)物質(zhì)及植物生長物質(zhì)的 培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)離體植物組織 ，并誘導(dǎo)使其長成完整植株的技術(shù)。 ? 植物組織培養(yǎng)是二十世紀(jì)發(fā)展起來的新技術(shù)，近三十年來由于組織培養(yǎng)基礎(chǔ)理論研究的深入，發(fā)展極為迅速，幾乎以植物為研究對象的各個(gè)分支學(xué)科都在廣泛進(jìn)行組織培養(yǎng)。 植物組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別 ? 組織培養(yǎng) ：指從機(jī)體內(nèi)取出組織或細(xì)胞 ， 模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件 ， 在體外進(jìn)行培養(yǎng) ， 使之生存或 生長成組織 。 ? 細(xì)胞培養(yǎng) ：指動(dòng)植物細(xì)胞在體外條件下的存活或生長 ， 此時(shí) 細(xì)胞不再形成組織 。 ? 植物組織培養(yǎng) ：主要指用于 植物快速繁殖 的組培技術(shù) 。 ? 植物細(xì)胞培養(yǎng) ：指以 生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物 （ 色素 、 固醇 、 生物堿 、 植物殺蟲劑等 ） 為目的的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 。 發(fā)展歷史 ? 1902年，德國植物學(xué)家 Haberlandt 根據(jù)細(xì)胞學(xué)說，提出單個(gè)細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性理論。 并首次嘗試分離植物組織并培養(yǎng)葉片細(xì)胞，但未成 功。他被稱為“植物組織培養(yǎng)之父”。 ? 1904年， Hanning 最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。 ? 1922年， Knudson 采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。 ? 1934年， White 用番茄根尖建立起第一個(gè)活躍生長的 無性繁殖系 ，從而使 非胚器官 的培養(yǎng)首先獲得成功。 ? 1948年 ， 斯科克發(fā)現(xiàn)腺嘌呤／生長素的比例是控制芽和根形成的重要條件 。 ? 1954年 ， Skoog發(fā)現(xiàn)一種叫 激動(dòng)素 的細(xì)胞分裂素它與生長素的比例可控制器官分化 。 ? 1958年，英國科學(xué)家 Steward 等用胡蘿卜根的愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出 胚狀體 并分化為完整的 小植株 ，不但使細(xì)胞全能性理論得到證實(shí)，而且為組織培養(yǎng)的技術(shù)程序奠定了基礎(chǔ)。 ? 1962年， Murashinge 和 Skoog 在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的 MS 培養(yǎng)基 。 ? 19641966年，印度科學(xué)家 Guha 和 Maheswari 在曼陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了 單倍體植株 。 ? 1972年， Carlson 通過兩個(gè)種的煙草原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得了 第一個(gè)體細(xì)胞雜交的雜種植株 。 ?? 20世紀(jì) 60年代 ， 植物組織培養(yǎng)開始大規(guī)模應(yīng)用 。 ? 1960年，莫雷爾用蘭屬的莖尖培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了去病 毒和快速繁殖。這一技術(shù)導(dǎo)致歐美“蘭花工業(yè)”的興起。 ? 20世紀(jì)中期，美國應(yīng)用組培技術(shù)獲得的芹菜苗已 經(jīng)成功地取代了種子繁殖的傳統(tǒng)方法。 ? 我國目前在番茄、辣椒、馬鈴薯、人參、花卉、 果品生產(chǎn)中廣泛投入應(yīng)用。 ? 組織培養(yǎng)技術(shù)被譽(yù)為農(nóng)業(yè)發(fā)展史上 第四次綠色革命。 植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ) ? 無性繁殖 （ asexual reproduction） 不經(jīng)生殖細(xì)胞結(jié)合的受精過程，由母體的一部分直接產(chǎn)生子代的繁殖方法。后代與親代在遺傳性上完全一致。 ? 林業(yè)上常用樹木營養(yǎng)器官的一部分和花芽、花 藥、雌配子體等材料進(jìn)行無性繁殖。花藥、花 芽、雌配子體常用組織培養(yǎng)法離體繁殖。生根后 的植物與母株的基因是完全相同的。 ? 無性繁殖的意義 ： ? 有性繁殖： 是用種子進(jìn)行播種繁殖，故又稱 種子繁殖 。 優(yōu)點(diǎn) ：是繁殖數(shù)量大，根系完整，生長健壯。 缺點(diǎn) ：是一些通過異花授粉的花卉容易發(fā)生變 異，不易保持原品種的優(yōu)良特征。 ? 無性繁殖： 是利用母體營養(yǎng)器官的一部分作為繁殖材料，進(jìn)行分生、扦插、壓條、嫁接繁殖和組織培養(yǎng)快速繁殖及植物的無融合生殖等，使之形成一個(gè)新的個(gè)體，所以又稱 營養(yǎng)繁殖 。 優(yōu)點(diǎn) ：是能保持品種的優(yōu)良特性、生長快、短期內(nèi) 獲得大量后代。 缺點(diǎn) ：是繁殖方法不如有性繁殖簡便。 植物細(xì)胞的 全能性 ? 植物細(xì)胞全能性：植物細(xì)胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。是植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)。 ? 實(shí)驗(yàn)表明，處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一過程，就是 植物組織培養(yǎng) 。 ? 植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)根據(jù) 細(xì)胞類型 不同 從強(qiáng)到弱 : 營養(yǎng)生長中心 形成層 薄壁細(xì)胞 特化細(xì)胞 (篩管、導(dǎo)管細(xì)胞 ) 厚壁細(xì)胞 (木質(zhì)化細(xì)胞 ) ； ? 根據(jù) 細(xì)胞所處的組織 不同 從強(qiáng)到弱 為： 頂端分生組織 居間分生組織 側(cè)生分生組織 薄壁組織 (基本組織 ) 厚角組織 輸導(dǎo)組織 厚壁組織。 植物細(xì)胞全能性的表達(dá) ? 脫分化 （ dedifferentiation)：分化的細(xì)胞在一定條件下，轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝誀顟B(tài)，重新獲得分裂能力。 ? 愈傷組織 ：脫分化細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組 織結(jié)構(gòu)、無明顯極性、松散的細(xì)胞團(tuán)。 ? 細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)被誘導(dǎo)激活，蛋白質(zhì)合成旺盛，RNA含量迅速增加。細(xì)胞進(jìn)入分裂期，形成愈傷組織。 ? 愈傷組織的誘導(dǎo)是植物細(xì)胞體外再生的第一步。 ? 愈傷組織的種類 胚性愈傷組織 ： 表面光滑、組織結(jié)構(gòu)緊湊、細(xì)胞小、再生力強(qiáng)。 在適宜的培養(yǎng)條件下能分化出再生植株的離體培養(yǎng)物 。 胚性愈傷組織容易 形成胚狀體。 非胚性愈傷組織 ： 表面粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松、細(xì)胞大， 呈淡黃色 。 不具備產(chǎn)生再生植株潛力的離體培養(yǎng)物 。 注意： ? 并不是所有的細(xì)胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織 。有些植物體的細(xì)胞脫分化以后直接形成胚性細(xì)胞，進(jìn)而形成體細(xì)胞胚。 ? 愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞并不都是未分化的細(xì)胞， 即同一愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞的分化狀態(tài)存在一定的差異。 細(xì)胞和組織分化與脫分化的區(qū)別 分化 脫分化 細(xì)胞區(qū)別 有絲分裂 ， 無液泡及蛋白體 無絲分裂為主 ， 出現(xiàn)液泡和蛋白體 形態(tài)區(qū)別 有特征 ， 排列規(guī)則 ， 有極性 ， 如髓分生組織等 沒有特征 ， 排列不規(guī)則 ， 沒有極性 生理區(qū)別 有專一的功能 沒有專一的功能 生化區(qū)別 有不同的化學(xué)組成和代謝方式 化學(xué)組成與代謝方式基本相同 ? 再分化 （ redifferentiation): 經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下，重新分化為各種類型細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育為完整植株。 ? 愈傷組織再分化的 2個(gè)途徑： 器官發(fā)生 ：將愈傷組織先后置于兩種培養(yǎng)基上，分別誘導(dǎo)形成芽和根。 胚狀體發(fā)生 ：愈傷組織形成類似種子的胚的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生芽端結(jié)構(gòu)與根端結(jié)構(gòu)，成為胚狀體。再進(jìn)一步發(fā)育為成熟胚。 胚狀體分為 ： ? 體細(xì)胞胚：來源于植物二倍體細(xì)胞（根、莖、葉），發(fā)育為正常可育植株。 ? 生殖細(xì)胞胚：來源于單倍體大、小孢子細(xì)胞，發(fā)育為單倍體植株。染色體加倍后可育。 ? 再分化期的細(xì)胞酶活性增強(qiáng)， RNA和組蛋白合成速 度加快，營養(yǎng)物質(zhì)積累。 ? 再分化期細(xì)胞的形態(tài)大小保持相對穩(wěn)定，細(xì)胞由 平周分裂轉(zhuǎn)變?yōu)榻M織內(nèi)部局部分裂，形成“瘤狀” 或“片狀”分生組織。 甘藍(lán) 辣椒 草莓 離體的植物器官、組織、細(xì)胞 脫分化 愈傷組織 再分化 根 芽 植物體 植物組織培養(yǎng)過程 植物組織培養(yǎng)條件： 含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的 PH、適時(shí)光照等。 影響細(xì)胞脫分化與再分化的因素 ? 激素 ： ? 生長素 能促進(jìn) 維管組織 形成 ? 細(xì)胞分裂素 與 木質(zhì)部 的發(fā)生有關(guān) ? 激素可能是通過在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上的調(diào)節(jié)作用而影響相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞分化。 ? 在植物中細(xì)胞種類的不同或同一種細(xì)胞不同的發(fā)育狀態(tài)，均會(huì)影響該種細(xì)胞對激素的反應(yīng)，所以很難尋找到不同激素在分化中作用的 共同模式。 ? 蔗糖濃度 ? 光照與溫度 光照對于 維管組織 的分化具有促進(jìn)作用， 適宜的溫度對于 維管組織 的分化是必需的。 植物組織培養(yǎng)特點(diǎn) ① 培養(yǎng)條件可以人為控制 組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于 穩(wěn)定地進(jìn)行培養(yǎng)生產(chǎn) 。 ② 生長周期短 ， 繁殖率高 植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此 生長較快 。另外，植株也比較小，往往 20— 30d為一個(gè)周期 。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說成本低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。 ③ 管理方便 ， 利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制 植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動(dòng)化控制生產(chǎn)。它是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的發(fā)展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲害等一系列繁雜勞動(dòng)，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。 植物組織培養(yǎng) 營養(yǎng)條件 —— 培養(yǎng)基 (culture medium) 是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同。因此， 沒有一種培養(yǎng)基能夠適合所有類型的植物組織或器官 ，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先 必須找到合適的培養(yǎng)基 ，培養(yǎng)才有可能成功。 培養(yǎng)基的種類 ? 培養(yǎng)基有許多種類 ， 根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基 。 ? Sacks(1680)和 Knop(1681)， 對綠色植物的成分進(jìn)行了分析研究 ， 根據(jù)植物從土中主要是吸收無機(jī)鹽營養(yǎng) ， 設(shè)計(jì)出了由無機(jī)鹽組成的 Sacks和 Knop溶液 ， 至今仍在作為基本的無機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用 。 ? White培養(yǎng)基 在 40年代用得較多 ， 現(xiàn)在還常用 。 ? 60和 70年代則大多采用 MS等高濃度培養(yǎng)基 ， 可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要 ， 并能生長快 、 分化快 。