【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包囗紙里面也要過火。 第二節(jié) 培養(yǎng)和馴化 ? 指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室 (有光照、溫度條件 )里，使之生長(zhǎng)，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。 1．培養(yǎng)方法 ? (1)固體培養(yǎng)法 即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡(jiǎn)單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長(zhǎng)速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。 ? (2)液體培養(yǎng)法 即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為 50100r／ min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。 2．培養(yǎng)步驟 ? (1)初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長(zhǎng)素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育的方向可分為： 1)頂芽和腋芽的發(fā)育 ? 采用外源的細(xì)胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長(zhǎng)，從而形成 一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個(gè)月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個(gè)枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽 —— 苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進(jìn)行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型扦插，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式。 ? 適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時(shí)，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。 ? 莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)行接種。在實(shí)際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。 ? 用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長(zhǎng)，有直立向上的莖梢，擴(kuò)繁時(shí)主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會(huì)生出不定芽，形成芽叢。 2)不定芽的發(fā)育 ? 在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性 (這與胚狀體不同 )。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。 ? 另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個(gè)器官上長(zhǎng)出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲(chǔ)藏器官能強(qiáng)烈地發(fā)生不定芽，用臼合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。 ? 在不定芽培養(yǎng)時(shí)，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。 3)體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育 ? 體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形、心形、魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時(shí)期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細(xì)胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生。 (2)繼代培養(yǎng) ? 在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢(shì)。 ? 繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級(jí)數(shù)增加的過程。如果以 2株苗為基礎(chǔ)，那么經(jīng) 10代將生成 210株苗。 ? 繼代培養(yǎng)中擴(kuò)繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于有伸長(zhǎng)的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡(jiǎn)便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是 MS0基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小，可先切成芽叢小塊，放人 MS0培養(yǎng)基中，待到稍大時(shí)，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。 ? 增殖使用的培養(yǎng)基對(duì)于一種植物來說每次幾乎完全相同．由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競(jìng)爭(zhēng)，所以能夠按幾何級(jí)數(shù)增殖；； ? 在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個(gè)必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進(jìn)行過程。但在達(dá)到相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。 培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的問題及解決方法 初代培養(yǎng)外植體的褐變 ? 外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會(huì)產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會(huì)抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。 褐變的主要原因 ? ① 植物品種 研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對(duì)不同的品種分別進(jìn)行處理。 ? ② 生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。 ? ③ 培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機(jī)鹽會(huì)使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會(huì)刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。 ? ④ 培養(yǎng)條件不當(dāng) 如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。 減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法 ? ① 選擇合適的外植體 一般來說，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。 ? ② 合適的培養(yǎng)條件 無機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。 ? ③ 使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、 PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用 %%的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。 ? ④ 連續(xù)轉(zhuǎn)移 對(duì)容易褐變的材料可間隔 12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理 7l0d后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。 繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化 ? 實(shí)踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會(huì)使試管苗生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。 ? 因?yàn)槌霈F(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。 ? 呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為： ? ① 增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢(shì)； ? ② 減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量； ? ③ 增加光照； ? ④ 增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行 CO2施肥，這對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用； ? ⑤ 降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生； ? ⑥ 降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。 3．生根培養(yǎng) ? 當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后 ， 就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段 。 若不能及時(shí)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去 ， 就會(huì)使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化 ， 或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費(fèi) 。 根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程 ， 這個(gè)過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯 。 生根培養(yǎng)可采用 1／ 2或者 1/4MS培養(yǎng)基 ， 全部去掉細(xì)胞分裂素 ， 并加入適量的生長(zhǎng)素 (NAA、 IBA等 )。 誘導(dǎo)生根方法： ? ① 將新梢基部浸入 50或 100 106I IBA溶液中處理 4— 8h； ② 在含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 46d； ③ 直接移入含有生長(zhǎng)素的生根培養(yǎng)基中 。 上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根 ， 但前二種方法對(duì)新生根的生長(zhǎng)發(fā)育則更為有利 。 而第三種對(duì)幼根的生長(zhǎng)有抑制作用 。其原因是當(dāng)根原始體形成后較高濃度生長(zhǎng)素的繼續(xù)存在 ， 則不利于幼根的生長(zhǎng)發(fā)育 。 不過這種方法比較可行 。 ? 另外也可采用下列方法就可生根：①延長(zhǎng)在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間；②有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量 (即將增殖與生根合并為一步 )；③切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻囵B(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長(zhǎng)素溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。 ? 另外少數(shù)植物生根比較困難時(shí)，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。 ? 從胚狀體發(fā)育成的小苗 ， 常常有原先已分化的根 ， 這種根可以不經(jīng)誘導(dǎo)生根階段而生長(zhǎng) 。 但因經(jīng)胚狀體途徑發(fā)育的苗數(shù)特別多 ， 并且個(gè)體較小 ， 所以也常需要一個(gè)低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段 ， 以便壯苗生根 。 ? 試管內(nèi)生根壯苗的階段 ， 為了成功地將苗移植到試管外的環(huán)境中 ， 以使試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境條件 。 通常不同植物的適宜馴化溫度不同 。 如菊花 ， 以 18～ 20℃ 為宜 。 實(shí)踐證明植物生長(zhǎng)的溫度過高不但會(huì)牽涉到蒸騰加強(qiáng) 。 而且還牽涉到菌類易滋生的問題 。 溫度過低使幼苗生長(zhǎng)遲緩 ， 或不易成活 。春季低溫時(shí)苗床可加設(shè)電熱線 ， 使墓質(zhì)溫度略高于氣溫 2～3℃ ， 這不但有利于生根和促進(jìn)根系發(fā)達(dá) ， 而且還有利于提前成活 。 ? 移植到試管外的植物苗光強(qiáng)度應(yīng)比移植前培養(yǎng)有所提高，并可適應(yīng)強(qiáng)度較高的漫射光， (約 4000h左右 )，以維持光合作用所需光照強(qiáng)度。但光線過強(qiáng)刺激蒸騰加強(qiáng)，會(huì)使水分平衡的矛盾更尖銳。 二、試管苗移栽馴化 ? 試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié) ， 這個(gè)工作環(huán)節(jié)做不好 ， 就會(huì)造成前功盡棄 。 為了做好試管苗的移栽 ， 應(yīng)選擇合適的基質(zhì) ， 并配合以相應(yīng)的管理措施 ，才能確保整個(gè)組織培養(yǎng)工作的順利完成 。 ? 試管苗由于是在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照和溫度近 100%的相對(duì)濕度環(huán)境條件下生長(zhǎng)的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長(zhǎng)的正常小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。 ? 從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超過普通苗。由此可知，試管苗更適合于高濕的環(huán)境生長(zhǎng)，當(dāng)將它們移栽到試管外環(huán)境時(shí)，試管苗失水率會(huì)很高，非常容易死亡。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形態(tài)特點(diǎn)，則必須經(jīng)過與外界相適應(yīng)的馴化處理另外，對(duì)栽培馴化基質(zhì)要進(jìn)行滅菌，因?yàn)樵嚬苊缭跓o菌的環(huán)境中生長(zhǎng)，對(duì)外界細(xì)菌、真菌的抵御能力極差。為了提高其成活率，在培養(yǎng)基質(zhì)中可摻入 75%的百菌清可濕性粉劑 200500倍液，以進(jìn)行滅菌處理。 ，通常