【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。赤霉素溶于酒精，配制時(shí)可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70％100％失效，應(yīng)當(dāng)過(guò)濾滅菌。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用量甚微，一般用mg／L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，～5 mg／L，～10 mg／L。(1)瓊脂：在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)。瓊脂能溶解在90℃以上熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量在6～10 g／L之間。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、pH等因素有關(guān)，長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過(guò)酸過(guò)堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時(shí)間過(guò)久，瓊脂變褐，也會(huì)逐漸喪失凝固能力。加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比，優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便，通氣問(wèn)題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等，缺點(diǎn)是培養(yǎng)物的吸收面積??；各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用；培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。(2)抗生物質(zhì)：抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20 mg／L之間。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失?？股馗饔衅湟志V，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但應(yīng)當(dāng)注意抗生素對(duì)植物組織的生長(zhǎng)也有抑制作用。（3）抗氧化物：培養(yǎng)基中添加抗氧化物是為了抑制外植體和培養(yǎng)物褐變。常用的抗氧化劑有半胱氨酸、維生素C、檸檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。（4）活性炭：活性炭有很強(qiáng)的吸附作用，它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚類、醌類物質(zhì)及激素等。～10g／L。培養(yǎng)基中添加活性炭的作用：防止褐化；促進(jìn)生根；降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率；活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用。但是，活性炭具有副作用：吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)；削弱瓊脂的凝固能力，添加時(shí)須注意。？？3. 培養(yǎng)基中添加的植物生長(zhǎng)調(diào)控物質(zhì)有哪些？ 各有什么作用？第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)（3）一、授課章節(jié) 第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)（3）。二、學(xué)時(shí)安排 2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1．掌握培養(yǎng)基母液的配制技術(shù)。2．掌握培養(yǎng)基的配制、分裝包扎技術(shù)。3．掌握培養(yǎng)基高壓滅菌技術(shù)。4．掌握無(wú)菌操作技術(shù)。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：1．培養(yǎng)基母液配制。2．培養(yǎng)基的制備技術(shù)。3．培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌。4．無(wú)菌操作技術(shù)。難點(diǎn)：1．培養(yǎng)基母液、培養(yǎng)基配制的計(jì)算。2．無(wú)菌操作技術(shù)步驟的剖析。五、教具電化教學(xué)設(shè)備、試管苗、接種工具、培養(yǎng)基。六、教學(xué)方法講授法，模擬實(shí)驗(yàn)法。七、教學(xué)過(guò)程Ⅰ.導(dǎo)入提問(wèn)：培養(yǎng)基的作用。復(fù)習(xí)：培養(yǎng)基的基本成分。（四）培養(yǎng)基的配制：所謂母液是欲配制培養(yǎng)液的濃縮液，也稱貯備液。母液配制的目的一是方便快速配制培養(yǎng)基，二是保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取。（1）母液配制方法●單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般mg/mL表示。●混配法：將幾類營(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后各類混合在一起定容到一定體積配成混合母液。（2）母液配制流程確定培養(yǎng)基配方確定母液種類計(jì)算稱量溶解混合定容分裝貼標(biāo)簽冰箱保存記錄（3）母液配制要求●母液濃縮倍數(shù)：大量元素10～20倍；微量元素100～200倍；鐵鹽100倍；有機(jī)物100～200倍。●選用蒸餾水，分析純或化學(xué)純?cè)噭?，防止沉淀?！窦に啬敢簼舛龋骸?mg/mL，1次配成50mL或100mL（4）藥品用量的計(jì)算：配制母液時(shí)藥品用量(mg)=配方用量(mg)濃縮倍數(shù)制備容量（L）（5）母液配制技術(shù) 以MS培養(yǎng)基為例，配制過(guò)程如下：表1 MS培養(yǎng)基母液配制（單位：mg/L）母液種類成分規(guī)定量擴(kuò)大倍數(shù)稱取量母液體積(mL)配1L培養(yǎng)基吸取量(mL)大量元素KNO3NH4N03MgSO47H20KH2P04CaCl22H2O190016503701704401019000165003700170044001000100微量元素MnS044H20ZnS047H20H3B03KINa2Mo042H20CuS045H20CoCl26H2010022308606208325l00010鐵鹽Na2EDTAFeS044H2010037302780100010有機(jī)物甘氨酸鹽酸硫胺素鹽酸吡哆醇煙酸肌醇10010020010505010000100010●大量元素母液 配成濃縮10倍的母液。，分別加入100mL左右蒸餾水中，再用磁力攪拌器攪拌促進(jìn)溶解，然后倒入1000mL容量瓶中，再加水定容至刻度，成為10倍母液。注意Ca2+和SO4PO43易發(fā)生沉淀，因此CaCl22H2O充分溶解后最后加入?！裎⒘吭啬敢? 配成濃縮100倍的母液。，分別溶解，混合后加水定容至1000mL?！耔F鹽母液 配成濃縮100倍的母液，分別溶解，混合后加水定容至1000mL?！裼袡C(jī)物母液 配成濃縮100倍的母液。，溶解，混合后加水定容至1000mL?！衩糠N激素必須單獨(dú)配成母液，～1mg／mL，用時(shí)根據(jù)需要取用。多數(shù)激素難溶于水，要先溶于特定溶劑，然后才能加水定容。具體方法為：IAA、IBA、GA、NAA等先溶于少量95％的酒精中，再加水定容到一定體積；2，再加水定容到一定體積；。（6）母液的保存 將配制好的母液分別倒入試劑瓶中，貼好標(biāo)簽，在標(biāo)簽上注明母液名稱，配制倍數(shù)與日期。然后放入冰箱內(nèi)4℃低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。（1）培養(yǎng)基配制工藝流程確定培養(yǎng)基配方及用量計(jì)算母液用量移取母液定容玻璃器皿洗滌調(diào)節(jié)pH分裝培養(yǎng)基熬制高壓滅菌干燥稱取瓊脂、蔗糖封口標(biāo)識(shí)、記錄（2）培養(yǎng)基制備的操作步驟●確定培養(yǎng)基配方及用量：根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象、培養(yǎng)目的等，通過(guò)查閱資料及咨詢等確定培養(yǎng)基配方，然后據(jù)外植體的數(shù)量和試驗(yàn)處理的多少確定培養(yǎng)基的用量?！穹Q取瓊脂、蔗糖：%～1%的瓊脂、2%～3%的蔗糖。●培養(yǎng)基熬制：量取純凈水放入加熱容器，純凈水的體積應(yīng)少于所配制培養(yǎng)基體積，約占終體積的2/3~3/4，加入稱量好的瓊脂和糖，接通電源加熱。邊加熱邊攪拌，防止糊底和溢出，至完全溶化?！衲敢喝∮昧康挠?jì)算：基本培養(yǎng)基配方成分母液取用量（mL）=1000247。濃縮倍數(shù)制備培養(yǎng)基的體積（L）；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液取用量（mL）=配方中的濃度（mg/L)247。母液濃度（mg/mL) 制備培養(yǎng)基體積（L）●移取母液：根據(jù)計(jì)算出的母液用量，按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分、植物激素的順序?qū)⒛敢喝〕?，混合?！穸ㄈ荩簩⒛敢夯旌弦杭尤氲江傊耆芑呐囵B(yǎng)基中，攪拌混勻，并加水定容到所需體積?！裾{(diào)節(jié)pH：用酸度計(jì)或精密pH試紙測(cè)試培養(yǎng)基溶液的pH(~)，，直到達(dá)到配方要求值?！穹盅b：用乳膠管把配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中，100～150mL的培養(yǎng)瓶每瓶裝入30～35mL左右的培養(yǎng)基，分裝時(shí)數(shù)量要均勻、合適，培養(yǎng)基不沾附瓶口和瓶壁。●封口：用合適的封口材料和線繩包扎。●標(biāo)識(shí)與記錄：封裝好的培養(yǎng)基做好標(biāo)記放到高壓滅菌鍋中準(zhǔn)備滅菌?！窦铀簻缇伡铀裂蜎](méi)電熱絲（或高低水位線之間）?！裱b鍋：將培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)器械放入高壓滅菌鍋?！衩芊猓悍忾]高壓滅菌鍋各出氣口?！窦訅海骸！衽艢猓簲嚅_(kāi)電源，打開(kāi)排氣閥，排冷氣至壓力為0MPa?！穹€(wěn)壓：接通電源，~～30min，此時(shí)溫度在121~125℃?！窠祲海悍€(wěn)壓時(shí)間到，關(guān)閉電源自然冷卻至壓力為0MPa。●出鍋：開(kāi)鍋后取出培養(yǎng)基冷卻，貯存于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)24h無(wú)雜菌生長(zhǎng)，可保存?zhèn)溆谩?、分裝和滅菌時(shí)注意的問(wèn)題（1）培養(yǎng)基熬制時(shí)邊煮邊攪拌，防止糊底。用旺火煮開(kāi)，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。（2）配制培養(yǎng)基一定按母液順序依次加入。（3）熬制培養(yǎng)基過(guò)程中，先放入難溶解的瓊脂及有機(jī)附加物（馬鈴薯、香蕉等），最后加入藥劑混合液，因混合液中的有機(jī)物遇熱時(shí)間長(zhǎng)易分解失效。（4）～，～，～。（5）分裝培養(yǎng)基時(shí)，注意不能將培養(yǎng)基溶液噴灑到瓶壁口處，容易落菌污染。（6）滅菌過(guò)程中須完全排除鍋內(nèi)冷水汽，使鍋內(nèi)全部是熱水蒸汽，滅菌才能徹底。（7）培養(yǎng)基滅菌嚴(yán)格按要求時(shí)間進(jìn)行，如超過(guò)時(shí)間，培養(yǎng)基成分發(fā)生變化易失效。（8）培養(yǎng)基滅菌后，立即取出擺平冷卻。取出過(guò)晚凝固差，影響接種轉(zhuǎn)苗質(zhì)量。四、無(wú)菌操作（接種）技術(shù)接種是指把無(wú)菌的植物材料切割，經(jīng)無(wú)菌操作手序，放到培養(yǎng)基上的全部操作過(guò)程。它是組織培養(yǎng)過(guò)程中易于污染的一個(gè)環(huán)節(jié)，接種操作必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行?！裨诮臃N前30min打開(kāi)無(wú)菌操作間和超凈工作臺(tái)的紫外燈進(jìn)行環(huán)境滅菌?！裾丈?0min后關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)風(fēng)機(jī)使超凈工作臺(tái)處于工作狀態(tài)?！窠臃N人員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等。●接種人員上工作臺(tái)后，用70%~75%酒精擦拭雙手，然后擦拭工作臺(tái)面?！裼?0%~75%酒精擦拭接種工具并反復(fù)灼燒?！襁M(jìn)行外植體表面滅菌與接種：將外植體3～5個(gè)為一組放入70%~75%的酒精溶液浸潤(rùn)10～60S→取出后再放入2%的次氯酸鈉溶液浸泡10～15min→用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3～5次（1min/次）→放入無(wú)菌吸水紙上吸干水分，進(jìn)行適當(dāng)切割→打開(kāi)已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基瓶蓋或封口膜，在酒精燈無(wú)菌圈內(nèi)接入外植體→封口。如此反復(fù)操作，直到全部外植體接種完成。注意工具用后及時(shí)滅菌，避免交叉污染?！窠臃N完畢，清理干凈工作臺(tái)。標(biāo)識(shí)接種材料并放入培養(yǎng)間培養(yǎng)。，需硝酸鉀多少克？？？第四節(jié) 植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)一、授課章節(jié) 第四節(jié) 植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)。二、學(xué)時(shí)安排 2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1．掌握植物組培快繁的流程。2．掌握植物組培快繁的程序。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：植物組培快繁的程序。難點(diǎn)：初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)外植體生長(zhǎng)與分化途徑。五、教具電化教學(xué)設(shè)備, 各培養(yǎng)階段的試管苗。六、教學(xué)方法講授法，演示法。七、教學(xué)過(guò)程Ⅰ.導(dǎo)入本次課主要介紹的是植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)。一、植物組培快繁的流程母體材料 → 外植體的選擇 → 外植體的處理 → 外植體的表面消毒 → 外植體的接種 → 初代培養(yǎng) → 繼代培養(yǎng)（多次循環(huán)）→ 壯苗與生根培養(yǎng) → 試管苗馴化與移栽二、植物組培快繁的程序（一）外植體的選擇●選擇優(yōu)良的種質(zhì) 外植體一定要選擇具有該品種典型特征、遺傳性穩(wěn)定、生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的優(yōu)良植株?！襁x擇生理狀態(tài)良好的材料 盡量選擇幼嫩的、生理狀態(tài)良好的材料?！襁x擇生長(zhǎng)旺盛、再生能力強(qiáng)的材料 在生長(zhǎng)季節(jié)選擇年幼的材料，這樣的材料生長(zhǎng)旺盛、再生力強(qiáng)，接種成功率高?！襁x擇來(lái)源豐富的材料 為了建立一個(gè)高效而穩(wěn)定的組培快繁體系，需反復(fù)試驗(yàn)，所以一定要選用來(lái)源豐富的材料?！襁x擇合適的外植體大小 適宜的外植體大?。骸?，莖段長(zhǎng)帶1～2個(gè)節(jié)。就無(wú)菌短枝扦插、叢生芽培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，木本植物、能形成莖段的草本植物以采取莖尖和莖段比較適宜；有些草本植物植株短小或沒(méi)有顯著的莖，可用葉片、葉柄、花萼、花瓣作外植體。（二）外植體的處理將采來(lái)的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來(lái)水沖凈洗衣粉水。洗滌結(jié)束后，進(jìn)入無(wú)菌操作室進(jìn)行消毒接種。（三）外植體的表面滅菌按照無(wú)菌操作技術(shù)中介紹的方法，打開(kāi)電源使超凈工作臺(tái)處于工作狀態(tài)，將接種工具、消毒的玻璃器皿、無(wú)菌水、配制好的滅菌劑等放入超凈工作臺(tái)，接種員做好準(zhǔn)備進(jìn)入無(wú)菌操作室，點(diǎn)燃酒精燈，對(duì)接種工具進(jìn)行灼燒滅菌。外植體每3～5個(gè)為一組放入70％~75％的酒精中浸泡10～60S→取出后放入2％的次氯酸鈉溶液浸泡10～15min→用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3～5次→用已滅菌的剪刀或解剖刀將外植體切割到適當(dāng)大小，準(zhǔn)備接種。（四）外植體的接種先打開(kāi)已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基瓶蓋或封口膜，將三角瓶?jī)A斜拿在手中，使瓶口靠近酒精燈火焰，并將瓶口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)灼燒數(shù)秒鐘。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入瓶?jī)?nèi)，輕輕插在培養(yǎng)基上。將葉片背面接觸培養(yǎng)基，莖尖、莖段要按其生長(zhǎng)極性的上下端，正放在培養(yǎng)基上。外植體接種以每瓶放一枚組塊為宜。接完種后，將瓶口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘，蓋上瓶蓋或封口膜。然后再接下一瓶，直到全部接種完畢。最后做好記錄，注明處理材料的物種名稱、處理方法、接種日期等。（五）培養(yǎng)（1）溫度 溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都在23~27℃之間進(jìn)行，一般采用25土2℃。（2）光照 主要表現(xiàn)在光強(qiáng)和光照時(shí)間方面。組織培養(yǎng)中多采用2000~3000Lx的光強(qiáng)，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。（3）濕度 影響組織培養(yǎng)的濕度包括以下兩個(gè)方面：培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度和培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的濕度。一般要求培養(yǎng)室內(nèi)要保持70％～80％的相對(duì)濕度。（4）培養(yǎng)基的pH 不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適pH的要求是不同的?！?。（5）滲透壓 培養(yǎng)基中由于有無(wú)機(jī)鹽類、蔗糖等化合物，因此，會(huì)影響滲透壓的變化。通常1~2個(gè)大氣壓對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上對(duì)植物生長(zhǎng)有阻礙作用。（6）氣體 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問(wèn)