【正文】 臺處于工作狀態(tài)。（5）分裝培養(yǎng)基時(shí)，注意不能將培養(yǎng)基溶液噴灑到瓶壁口處，容易落菌污染?！穹€(wěn)壓：接通電源，~～30min，此時(shí)溫度在121~125℃?！穹盅b：用乳膠管把配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中，100～150mL的培養(yǎng)瓶每瓶裝入30～35mL左右的培養(yǎng)基，分裝時(shí)數(shù)量要均勻、合適，培養(yǎng)基不沾附瓶口和瓶壁?！穹Q取瓊脂、蔗糖：%～1%的瓊脂、2%～3%的蔗糖。●有機(jī)物母液 配成濃縮100倍的母液。6H2010022308606208325l00010鐵鹽Na2EDTAFeS04●選用蒸餾水，分析純或化學(xué)純試劑，防止沉淀。七、教學(xué)過程Ⅰ.導(dǎo)入提問：培養(yǎng)基的作用。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：1．培養(yǎng)基母液配制。培養(yǎng)基中添加活性炭的作用：防止褐化；促進(jìn)生根；降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率；活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用。(2)抗生物質(zhì)：抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20 mg／L之間。(1)瓊脂：在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。（2）細(xì)胞分裂素類：作用能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?，4D＞NAA＞IBA＞IAA。 馬鈴薯 去掉皮和芽后，加水煮30 min，經(jīng)過過濾，取其濾液使用。 椰乳 是椰子的液體胚乳。 種類：硫胺素(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、煙酸(維生素B3，又稱維生素PP)、泛酸(維生素B5)、生物素(維生素H)、鈷胺素(維生素B12)、葉酸(維生素B11）等。(1)糖類：這類有機(jī)物的作用一是培養(yǎng)物賴以生長的碳源；二是使培養(yǎng)基維持一定的滲透壓。2H20等化合物來提供。廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)B51968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)除含有較高的鉀鹽外，還含有較低的氨態(tài)氮和較高的鹽酸硫胺素適合雙子葉植物，尤其木本植物的培養(yǎng)White1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)無機(jī)鹽數(shù)量較低，提高了MgSO4的濃度適于生根培養(yǎng)SH1972年由Schenk和Hidebrandt設(shè)計(jì)鹽分濃度較高，銨態(tài)氮含量較低，鹽酸硫胺素和硝酸鉀含量較高在不少單子葉和雙子葉植物的組培中應(yīng)用效果較好Knudson C1922年由Knudson為蘭科種子培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，后經(jīng)多次改良成分簡單，不能滿足大多數(shù)植物組織細(xì)胞的生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)適用于蘭科植物種子培養(yǎng)和萌發(fā)VWVacin 和Went 在1949年設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的總離子強(qiáng)度稍低些，磷以磷酸鈣的形式供給適用于氣生蘭的組培N61974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)成分較簡單，KN03和(NH4)2S04含量高適用于單子葉植物花藥培養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)（三）培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基主要有水、無機(jī)鹽、有機(jī)物、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)基的支持材料五大類組成。H20Na2SO4Na2—EDTA3701702501507201720040015250250250250185400FeSO4誘導(dǎo)培養(yǎng)基：初代培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)外植體生長與脫分化的培養(yǎng)基。沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一種合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。3．了解培養(yǎng)基的類型。：從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物，因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面消毒處理。在干熱條件下，細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞抗熱性大為提高，故能源消耗大，又浪費(fèi)時(shí)間，所以目前多采用濕熱滅菌代替，接種工具也可采用消毒器烘烤和酒精燈外焰灼燒的方法消毒。緩沖間、接種間、培養(yǎng)間等均可采用紫外線照射消毒，一般照射20~30min。無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他理化滅菌方法處理后的物體一般可認(rèn)為是無菌的。（二）各類器皿和用具的洗滌方法：使用前先用1%稀鹽酸浸泡12～24h→用毛刷蘸洗衣粉水刷洗干凈→流水沖洗3～4次→最后用蒸餾水沖淋1遍→晾干（或烘干）后備用。本次課主要介紹的是植物組織培養(yǎng)洗滌和消毒滅菌技術(shù)。三、教學(xué)目標(biāo)1．掌握組培的一般工作程序。（六）其它設(shè)備與用具：磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如各種化學(xué)物質(zhì)等。：用于配制培養(yǎng)基母液時(shí)溶解各種化合物，規(guī)格有50～1000mL不等。（3）果醬瓶：主要用于繼代和生根培養(yǎng)。：對于一些對環(huán)境條件要求特別嚴(yán)格的培養(yǎng)物，可培養(yǎng)在能自動調(diào)控溫度、濕度、光照等的智能光照培養(yǎng)箱里。根據(jù)風(fēng)幕形成的方式可分為水平風(fēng)和垂直風(fēng)兩種；根據(jù)使用方式分為單人單面、雙人單面、雙人雙面等。（3）儀器與用具配置：移栽容器、彌霧裝置、遮陽網(wǎng)、移栽基質(zhì)等。（2）設(shè)計(jì)要求：培養(yǎng)間的大小可根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模和培養(yǎng)架的大小、數(shù)目及其它附屬設(shè)備而定。（2）設(shè)計(jì)要求：接種室宜小不宜大，一般7~8m2。（1）任務(wù)：主要負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。（1）任務(wù)：主要用于化學(xué)藥品的儲藏、稱量和溶液的配制。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：組培工廠的設(shè)計(jì)原則與總體要求。植物的體細(xì)胞一旦脫離所在器官或組織的束縛成為離體狀態(tài)時(shí)，在一定的營養(yǎng)、激素和外界條件作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，而生長發(fā)育成為完整的植株。原生質(zhì)體培養(yǎng)：對除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。七、教學(xué)過程Ⅰ.導(dǎo)入前面我們學(xué)習(xí)了有關(guān)植物育種的一些知識，今天，請看我給同學(xué)們看一樣?xùn)|西(教師拿出試管苗)，問同學(xué)們這是什么呢？這就是我們要學(xué)的植物組織培養(yǎng)。三、教學(xué)目標(biāo)1．掌握植物組織培養(yǎng)的含義。4．掌握植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)和應(yīng)用。二、植物組織培養(yǎng)的類型植物組織培養(yǎng)由于分類依據(jù)不同可劃分為不同的類型。根據(jù)培養(yǎng)過程初代培養(yǎng)：將外植體進(jìn)行的第一次培養(yǎng)。二、學(xué)時(shí)安排 2學(xué)時(shí)。六、教學(xué)方法講授法，演示法。（二）具體要求、陽光充足、無高大建筑物遮擋的環(huán)境；最好在常年主風(fēng)向的上風(fēng)方向，盡量減少污染；要求交通便利，便于產(chǎn)品的運(yùn)送。注意磁力攪拌器與電子天平要分開臺面放置。地面、墻壁應(yīng)用耐濕材料鋪設(shè)，防水、防潮、防腐蝕。房間密閉，干爽安靜，清潔明亮。能夠控制光照和溫度，并保持相對的無菌環(huán)境；適當(dāng)位置安裝紫外燈進(jìn)行照射滅菌。主要用于赤霉素、玉米素、脫落酸等不耐熱物質(zhì)的滅菌。：包括雙目體視顯微鏡(解剖鏡)、生物顯微鏡、倒置顯微鏡和電子顯微鏡，用于剝離莖尖和進(jìn)行培養(yǎng)物的觀察、分析、拍照等。規(guī)格有50mL，l00mL，150mL，250mL，500mL等，一般使用l50mL三角瓶。（4）塑料瓶：主要用于蘭科植物的培養(yǎng)。：用于吸取各種用量較少的母液，～10mL不等。：用于存放各種化學(xué)藥品。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn)：常用的消毒滅菌技術(shù)。 由重鉻酸鉀和濃硫酸混合而成，屬強(qiáng)氧化劑，對無機(jī)離子、灰塵效果好，對油污無效。、量筒等量器：鉻酸洗滌液中浸泡2h以上→取出后在流水中沖洗30min→蒸餾水沖淋1次→晾干（或烘干）后備用。由滅菌和消毒的含義可以看出，二者的主要區(qū)別是：滅菌是把所有有生命的物質(zhì)全部殺死；而消毒主要?dú)⑺阑蛞种莆矬w表面的微生物，但芽孢、厚垣孢子一般不會死亡。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，按2mL／m3用量，將甲醛置于廣口容器中?！癫潦孟荆航臃N用具及超凈工作臺表面等使用前可用70%~%新潔爾滅溶液進(jìn)行擦拭消毒。外植體一般采用浸泡消毒的方法，具體方法在以后課程中講授。五、教具電化教學(xué)設(shè)備。根據(jù)培養(yǎng)階段根據(jù)培養(yǎng)進(jìn)程根據(jù)營養(yǎng)水平初代培養(yǎng)基：初代培養(yǎng)階段所用的培養(yǎng)基。 目前已公開報(bào)道的基本培養(yǎng)基有許多種類，各有不同的特點(diǎn)和適用范圍，在植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)不同的植物種類和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的選用不同的培養(yǎng)基。4H20ZnSO4配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以確保母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。同時(shí)，它又是葉綠素形成必要的。 作用：在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用；參與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的構(gòu)建；能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成；對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用。如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小若超過1 mm時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基的關(guān)鍵性物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用，控制著培養(yǎng)物的脫分化、再分化和形態(tài)建成。其他3種生長素為人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞。③抑制根的分化。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長。瓊脂的用量在6～10 g／L之間。但應(yīng)當(dāng)注意抗生素對植物組織的生長也有抑制作用。二、學(xué)時(shí)安排 2學(xué)時(shí)。4．無菌操作技術(shù)。母液配制的目的一是方便快速配制培養(yǎng)基，二是保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取。2H2O190016503701704401019000165003700170044001000100微量元素MnS04注意Ca2+和SO4PO43易發(fā)生沉淀，因此CaCl2多數(shù)激素難溶于水，要先溶于特定溶劑，然后才能加水定容。●母液取用量的計(jì)算：基本培養(yǎng)基配方成分母液取用量（mL）=1000247。●加水：滅菌鍋加水至淹沒電熱絲（或高低水位線之間）。、分裝和滅菌時(shí)注意的問題（1）培養(yǎng)基熬制時(shí)邊煮邊攪拌，防止糊底。（8）培養(yǎng)基滅菌后，立即取出擺平冷卻?！裼?0%~75%酒精擦拭接種工具并反復(fù)灼燒。三、教學(xué)目標(biāo)1．掌握植物組培快繁的流程。●選擇生理狀態(tài)良好的材料 盡量選擇幼嫩的、生理狀態(tài)良好的材料。外植體每3～5個(gè)為一組放入70％~75％的酒精中浸泡10～60S→取出后放入2％的次氯酸鈉溶液浸泡10～15min→用無菌水反復(fù)沖洗3～5次→用已滅菌的剪刀或解剖刀將外植體切割到適當(dāng)大小，準(zhǔn)備接種。（五）培養(yǎng)（1）溫度 溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都在23~27℃之間進(jìn)行，一般采用25土2℃。通常1~2個(gè)大氣壓對植物生長有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上對植物生長有阻礙作用。再將新形成的芽切割下來繼續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)萌生新的枝條，在很短的時(shí)間內(nèi)重復(fù)芽→枝→苗的再生過程，就能生產(chǎn)出許多再生小植株。（4）原球莖的發(fā)育蘭科植物的組培過程中，由莖尖或側(cè)芽產(chǎn)生原球莖，原球莖不斷增殖，逐漸分化成為小植株。一般情況，在4～6周內(nèi)增殖3～4倍是很容易做到的。2℃。（1）苗床準(zhǔn)備：草本植物移栽于苗床（寬度1m，長度根據(jù)溫室跨度而定）中，直接在苗床中鋪上栽培基質(zhì)（如蛭石、珍珠巖、草炭等），澆透水即可。（2）防止菌類滋生 對基質(zhì)進(jìn)行高壓滅菌或烘烤滅菌；適當(dāng)使用一定濃度的殺菌劑如多菌靈、托布津800～1000倍液，噴藥宜7～10d一次。？？？？怎樣進(jìn)行試管苗的移栽？怎樣對馴化的試管苗進(jìn)行管理?第五節(jié) 植物脫毒技術(shù)一、授課章節(jié) 第五節(jié) 植物脫毒技術(shù)。六、教學(xué)方法講授法，演示法。此方法簡便易行，但易造成材料受傷?！駥χ仓暧袀?，只有部分植株成活。先用肉眼剝離外面的幼葉，再移至雙筒解剖鏡下，用鑷子夾住莖部，用解剖針輕輕剝掉幼葉和葉原基，解剖針可蘸少許酒精，過火滅菌，但要注意解剖針的冷卻，當(dāng)剝到看見一個(gè)閃亮半圓球的頂端分生組織點(diǎn)，只剩兩枚葉原基時(shí)，可用解剖刀將微莖尖切下來，然后接到培養(yǎng)基中，注意隨切隨接，防止變干變褐。但莖尖大小與莖尖的成活率成正相關(guān)，即莖尖越小培養(yǎng)難度越大，成活率越低?！裰和磕ǚǎ簭拇郎y植物中取1～3g幼葉置研缽中→ mol／L磷酸緩沖液()→磨成勻漿→用棉球蘸少量漿液和500～600目金剛砂→在指示植物葉片上輕輕涂抹（以使?jié){液能浸入葉片表皮細(xì)胞但又不損傷葉片為度）→約5min后用清水沖洗葉面→將被接種的指示植物置于防蚜蟲網(wǎng)室(15～25℃)內(nèi)培養(yǎng)。(2)缺點(diǎn)：不能測出病毒總的核蛋白濃度，而只能測出病毒的相對感染力。(1)優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高；操作簡便、安全、快速；無需特殊儀器設(shè)備，結(jié)果容易判斷；可同時(shí)檢測大量的樣品。（一）隔離保存植物病毒的傳播媒介主要是昆蟲如蚜蟲、葉蟬或土壤線蟲等，因此應(yīng)將無病毒原原種苗種植于防蟲網(wǎng)室中，以300目的網(wǎng)紗為好，可防止介體昆蟲進(jìn)入。在應(yīng)用無病毒苗時(shí)，建立無毒原原種、原種繁育圃，經(jīng)常抽查病毒的感染情況，隨時(shí)脫毒復(fù)壯，及時(shí)向生產(chǎn)基地供應(yīng)無毒種苗。4．通過馬鈴薯組培脫毒技術(shù)的學(xué)習(xí)，進(jìn)一步理解和掌握植物脫毒與快繁技術(shù)。在種苗生產(chǎn)上運(yùn)用最為廣泛的方法是扦插和組培。將莖段兩端的切口再切去一小段，這樣可減少滅菌藥物的毒害。而花蕾外植體經(jīng)過15～20d的培養(yǎng)，會形成愈傷組織；再經(jīng)過20～30d的培養(yǎng)，愈傷組織就會分化出較多的叢生芽。剪取2～3cm無根苗，插植到珍珠巖或蛭石的基質(zhì)中，基質(zhì)事先用生根激素溶液浸透，l0d后生根率可達(dá)95％～100％。蝴蝶蘭是單莖性熱帶氣生蘭，只有一個(gè)莖尖，如果直接從開花植株取得莖尖或莖段，整株造成浪費(fèi)。amp?；üＲ秆空T導(dǎo)出叢生芽后，接種于繼代培養(yǎng)基1／3MS+NAA mg/L+ BA1～10mg/L()，培養(yǎng)溫度(26177。3d以后，用鑷子將小苗輕輕夾出培養(yǎng)瓶，洗凈根部培養(yǎng)基。通過組織培養(yǎng)技術(shù)繁育大花蕙蘭種苗，是目前生產(chǎn)中最常用、最有效的方法。 將2cm左右高的莖芽從原球莖團(tuán)塊上切下，接種到1/2MS+ ～+～，莖芽2周后開始生根，葉片伸長、植株增高；1個(gè)月后可長成高5cm以上的完整植株。（二）培養(yǎng)程序 以幼枝切段為外植體：取直徑為5～15mm的當(dāng)年枝條，整理成長度為2～。再經(jīng)10～15d培養(yǎng)，即可成為根系發(fā)育良好的完整試管小植株。 剪取1～2cm長的芽，剝?nèi)ヒ壮~片，在自來水下沖洗1h左右，于超凈工作臺上進(jìn)行消毒滅菌。 ③接種液制備 葉片洗凈后，在消毒研缽中研成糊狀