植物組織培養(yǎng)(編輯修改稿)
2025-02-03 04:56 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 (2)慢速冰凍法：通常成熟的植物細胞都具有大的液泡，含有大量水分。對大多數(shù)植物材料說來，不適宜采用快速冰凍法，而需要在冰凍保護劑存在的條件下，采用慢速冰凍法。 以每分鐘 0. 110℃ 的降溫速度 (一般 1— 2℃ ／分較好 )。降到 — 70℃ 左右 ，隨即浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到一 196℃ 。在這種降溫速度下，可以使細胞內(nèi)的水分有充足的時間不斷流到細胞外結(jié)冰，從而使細胞內(nèi)的水分減少到最低限度，達到良好的脫水效應(yīng)，避免細胞內(nèi)結(jié)冰。 (3)兩步冰凍法：這種方法是慢凍法和快凍法的結(jié)合，或者說，是一種改良的慢凍法。 第一步是用慢速降溫法從 0℃ 降到一定的預(yù)凍溫度，使細胞達到適當?shù)谋Ｗo性脫水； 第二步，投入液氮中迅速冰凍。 (4)逐級冰凍法：此方法是制備不同等級溫度的冰浴，如 — 10℃ ， — 15℃ ， — 23℃ ， — 35℃ ，或 — 40℃ 等。保存材料經(jīng)冰凍保護劑在 0℃ 預(yù)處理后，逐步通過這些溫度，樣品在每級溫度 上停留一定時間 (4— 6分鐘 )，然后浸入液氮。 5．化凍方法 實驗證據(jù)證實， 植物的凍害常發(fā)生在冰涼和化凍兩個過程 。 因此要使植物種質(zhì)的超低溫保存獲得成功，不僅要求有一個合適的降溫冰凍程序，而且還要求采取合適的化凍方法，以避免在化凍過程中產(chǎn)生細胞內(nèi)的次生結(jié)冰，并應(yīng)防止在化凍吸水過程中水的滲透沖擊對細胞膜體系的破壞。 通常采用快速化凍方法，即將液氮保存后的材料在 37— 40℃ 的溫水浴中化凍。因為超低溫冰凍材料化凍時，再次結(jié)冰的危險溫度區(qū)域大約是 —50℃ 至 — 10℃ 。從理論上說，借助迅速的化凍速度通過此溫度區(qū)，從而避免細胞內(nèi)次生結(jié)冰。 6．光照對恢復(fù)生長的影響 黑暗條件下有利于超低溫保存培養(yǎng)物的恢復(fù)生長。 1. 顯示細跑活力的 TTC法 (氯化三苯四氮唑還原法 ) ，反映脫氫酶活力。 2. 2．顯示細胞存活率的二醋酸酯熒光素 (FDA)染色法，反映酯酶的脫脂化作用，或采用中性紅染色法。 3. 3. 再培養(yǎng) 新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。存在停滯期。 六、超低溫保存后細胞活力、存活率及遺傳特性的觀測 4. 遺傳性狀的分析： 1)細胞全能性的保持：形態(tài)發(fā)生能力的表達情況。 2)后代的形態(tài)特征及生長發(fā)育狀況。 3)后代染色體的分析。 4)同工酶譜的分析。 5)特殊產(chǎn)物的分析。 6)抗逆性的分析。 1. 已進行超低溫保存的植物： 目前已超過 30種植物 成功進行了愈傷組織及懸浮細胞超低溫保存。保存后的材料表現(xiàn)出較高的存活率。 七、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細胞的超低溫保存 2．組織和細胞超低溫保存實驗程序 (1)將培養(yǎng) 5一 7天的懸浮培養(yǎng)細胞，或培養(yǎng) 10一 15天的愈傷組織 收集于保存試管中，每管 。 (2)將盛有材料的試管 插入冰浴中 ， 待溫度平衡后， 加入0℃ 預(yù)冷的冰凍保護劑 (10％ DMSO + mo1／ L 山梨糖醇 )，使保護劑稍淹過保存材料。在 0℃ 放置 30分鐘。 (3)以 1℃ ／分的降溫速度從 0℃ 降到 10℃ ，輕輕搖動試管，使試管內(nèi)的溶液結(jié)冰。停留 15－ 20分鐘。然后以同樣降溫進度降到 30℃ － 40℃ ，停留 2小時，然后浸入液氮中。 (4)在液氮中貯存一定時期后，取出材料在 37— 40℃ 溫水浴迅速化凍， 化凍后立即轉(zhuǎn)移到 20℃ 水浴中。 (5)化凍后，用 含 3％蔗糖的液體培養(yǎng)基洗滌 3次， 為減輕和避免滲透沖擊的傷害，培養(yǎng)液應(yīng)逐步加入。 (6)洗滌后立即 轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上進行再培養(yǎng) ：或者不經(jīng)洗滌，直接轉(zhuǎn)
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