【文章內(nèi)容簡介】 參考一抗的說明書，按照適當比例用 Western一抗稀釋液稀釋一抗。 加入稀釋好的一抗，室溫或 4℃ 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時?；蛘咴?4℃ 緩慢搖動孵育過夜。 洗滌 3次。 二抗孵育 (Secondary antibody inucubation) 參考二抗的說明書，按照適當比例用 Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶 (HRP)標記的二抗。 加入稀釋好的二抗，室溫或 4℃ 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。 洗滌 3次 蛋白檢測 (Detection of proteins) 參考相關(guān)說明書，使用 BeyoECL, Western 熒光檢測試劑等 ECL類試劑來檢測蛋白。 洗片時可以使用 X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。 ? 轉(zhuǎn)化當代的外源基因整合和表達 – 表型證據(jù) – 分子生物學(xué)證據(jù) ? 轉(zhuǎn)基因生物的完整鑒定還需要提供以下證據(jù) – 轉(zhuǎn)化體當代性狀表現(xiàn)的證據(jù)（如抗蟲、抗病等） – 轉(zhuǎn)化體表型性狀遺傳的證據(jù) ? 有性繁殖作物應(yīng)能傳遞到后代 ? 無性繁殖作物繁殖一代應(yīng)穩(wěn)定遺傳 – 以上各方面均要求設(shè)置嚴格的對照 轉(zhuǎn)基因的遺傳 一、轉(zhuǎn)基因的整合位點和拷貝數(shù)對其功能表達及遺傳的影響 二、轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性 三、轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)化植株中的遺傳傳遞規(guī)律 四、轉(zhuǎn)化方法對整合的外源基因結(jié)構(gòu)及遺傳特性的影響 1. 轉(zhuǎn)基因整合特點 2. 轉(zhuǎn)基因整合的遺傳效應(yīng) 3. 轉(zhuǎn)基因沉默 一、轉(zhuǎn)基因的整合位點和拷貝數(shù)對其功能表達及遺傳的影響 轉(zhuǎn)基因整合的遺傳效應(yīng) ? 位置效應(yīng) 外源基因插入拷貝數(shù)相同但由于插入位置不同而造成該基因表達量不同的現(xiàn)象稱為位置效應(yīng) ? 同源基因的共抑制效應(yīng) 插入的外源基因與植物基因組內(nèi)部的產(chǎn)生基因同源共抑制效應(yīng) 插入的外源基因之間的同源共抑制效應(yīng) ? 外源基因重排 同源基因的異位配對造成寄主染色體重排 轉(zhuǎn)基因沉默 ? 位置效應(yīng) ? 基因及啟動子的甲基化 ? 重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默 ? 同源基因的共抑制效應(yīng) 甲基化導(dǎo)致 基因沉默 ? 甲基化 當一個或多拷貝基因整合進入或接近高甲基化基因組序列時，轉(zhuǎn)基因的順式失活就可能發(fā)生。 （ 1）植物中的甲基化可以進行傳遞，當甲基化傳遞進轉(zhuǎn)基因中時，就會導(dǎo)致基因沉默。 （ 2）多拷貝基因整合進一個甲基化位點時也能產(chǎn)生順式轉(zhuǎn)錄沉默，重復(fù)誘導(dǎo)失活。 （ 3）有時轉(zhuǎn)基因以單拷貝插入一個高甲基化位點也能引起轉(zhuǎn)錄基因沉默 。 ? 總的來說甲基化（或超甲基化）和染色質(zhì)凝集（異染色質(zhì)化）是與轉(zhuǎn)錄基因沉默相關(guān)聯(lián)的普遍特征。 重復(fù)序列誘導(dǎo)基因沉默 ? 外源基因多拷貝形式整合到同一位點 重復(fù)序列自發(fā)配對 甲基化酶特異識別這種配對結(jié)構(gòu)進而使其甲基化，或異染色質(zhì)化相關(guān)蛋白識別重復(fù)序列間配對形成的拓撲結(jié)構(gòu)。 同源基因的共抑制效應(yīng) ? 共抑制是指在外源基因沉默的同時，與其同源的內(nèi)源 DNA的表達也受到抑制。 轉(zhuǎn)錄后基因沉默（ PTGS） ? 轉(zhuǎn)錄后基因沉默：轉(zhuǎn)錄能進行但 mRNA不能積累而發(fā)生的基因沉默。它也可分為轉(zhuǎn)錄后順式失活和轉(zhuǎn)錄后反式失活（共抑制）。 ? PTGS在單倍體和純合體中發(fā)生的概率較雜合體要高，表現(xiàn)出基因劑量效應(yīng)；使用雙增強子的 35s啟動子比使用經(jīng)典的 35s啟動子發(fā)生 PTGS的頻率要高。根據(jù)前人的研究結(jié)果， Dehio和 Schell提出了 PTGS可能的分子機制 ——閾值假說（ threshold hypothesis）：PTGS是因為轉(zhuǎn)基因 RNA的過量產(chǎn)生造成的，當RNA超過了一定的閾值水平，通過 RNA—RNA相互作用和 /或反義 RNA（ cRNA）引發(fā) mRNA的不可逆降解。 二、轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性 ? 減數(shù)分裂配子形成過程中丟失 ? 外源 DNA是在細胞質(zhì)基因組中整合 ? 配子中外源 DNA引起致死突變 ? 外源基因插入引起的基因重排、丟失 ? 外源 DNA的共抑制效應(yīng)及甲基化使基因失活 三、轉(zhuǎn)基因的遺傳規(guī)律 ? 單位點插入 孟德爾單基因遺傳規(guī)律 ? 多位點插入 較為復(fù)雜 四、轉(zhuǎn)化方法對整合的外源基因結(jié)構(gòu)及遺傳特性的影響 ? 農(nóng)桿菌侵染方法 ? TDNA串聯(lián)、 TDNA截短 ? 直接轉(zhuǎn)化 DNA的方法 ? 發(fā)生 DNA環(huán)化甲基化、片段分離以及丟失和重排等 已經(jīng)整合到基因組中的能穩(wěn)定遺傳 轉(zhuǎn)基因的安全性及安全評價 ? 轉(zhuǎn)基因食品安全嗎？ ? 面對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的爭議，轉(zhuǎn)基因為人類帶來的利益和風險，我們的路該怎樣走？ 對轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭論，國際上有幾個典型的事件。 Pusztai事件： 英國 Rowett研究所有位 Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠， 1998年秋天在英國電視臺發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。 后果： 綠色和平組織、地球之友等反生物技術(shù)組織把這種土豆說成“殺手”，并策劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗地等行動，焚燒了印度的兩塊試驗田，甚至美國加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗材料也遭破壞，以致研究生畢業(yè)論文都無法如期完成。 英國皇家學(xué)會組織了同行評審，并于 1999年５月發(fā)表評論，指出 Pusztai的試驗有六方面的錯誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標準食物，缺少統(tǒng)計學(xué)意義；試驗設(shè)計差；統(tǒng)計方法不當；試驗結(jié)果無一致性等。 斑蝶事件： 1999年 5月，康奈爾大學(xué)的一個研究組在《 Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導(dǎo)致 44％的幼蟲死亡。 這一實驗結(jié)果在科學(xué)上沒有說服力：玉米的花粉非常重，擴散不遠，在玉米地以外５米，馬利筋葉片 /CM2上只找到一個玉米花粉； 2023年開始在美國三個州和加拿大進行的田間試驗都證明，抗蟲玉米花粉對斑蝶并不構(gòu)成威脅，實驗室試驗中用１０倍于田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發(fā)現(xiàn)對其生長發(fā)育有影響。 斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。 加拿大“超級雜草”事件 ： 由于基因漂流，在加拿大油菜地里發(fā)現(xiàn)了個別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級雜草”，并