轉(zhuǎn)基因鑒定與安全性評(píng)估-文庫(kù)吧資料
2025-03-02 22:44本頁(yè)面
【正文】 由于基因漂流，在加拿大油菜地里發(fā)現(xiàn)了個(gè)別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級(jí)雜草”，并怪罪于轉(zhuǎn)基因。 這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在科學(xué)上沒(méi)有說(shuō)服力：玉米的花粉非常重，擴(kuò)散不遠(yuǎn)，在玉米地以外５米，馬利筋葉片 /CM2上只找到一個(gè)玉米花粉； 2023年開(kāi)始在美國(guó)三個(gè)州和加拿大進(jìn)行的田間試驗(yàn)都證明，抗蟲玉米花粉對(duì)斑蝶并不構(gòu)成威脅，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中用１０倍于田間的花粉量來(lái)喂大斑蝶的幼蟲，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有影響。 英國(guó)皇家學(xué)會(huì)組織了同行評(píng)審，并于 1999年５月發(fā)表評(píng)論，指出 Pusztai的試驗(yàn)有六方面的錯(cuò)誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對(duì)食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補(bǔ)充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動(dòng)物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)食物，缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)設(shè)計(jì)差；統(tǒng)計(jì)方法不當(dāng)；試驗(yàn)結(jié)果無(wú)一致性等。 Pusztai事件： 英國(guó) Rowett研究所有位 Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠， 1998年秋天在英國(guó)電視臺(tái)發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。根據(jù)前人的研究結(jié)果， Dehio和 Schell提出了 PTGS可能的分子機(jī)制 ——閾值假說(shuō)（ threshold hypothesis）：PTGS是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因 RNA的過(guò)量產(chǎn)生造成的，當(dāng)RNA超過(guò)了一定的閾值水平，通過(guò) RNA—RNA相互作用和 /或反義 RNA（ cRNA）引發(fā) mRNA的不可逆降解。它也可分為轉(zhuǎn)錄后順式失活和轉(zhuǎn)錄后反式失活（共抑制）。 同源基因的共抑制效應(yīng) ? 共抑制是指在外源基因沉默的同時(shí)，與其同源的內(nèi)源 DNA的表達(dá)也受到抑制。 ? 總的來(lái)說(shuō)甲基化（或超甲基化）和染色質(zhì)凝集（異染色質(zhì)化）是與轉(zhuǎn)錄基因沉默相關(guān)聯(lián)的普遍特征。 （ 2）多拷貝基因整合進(jìn)一個(gè)甲基化位點(diǎn)時(shí)也能產(chǎn)生順式轉(zhuǎn)錄沉默，重復(fù)誘導(dǎo)失活。 ? 轉(zhuǎn)化當(dāng)代的外源基因整合和表達(dá) – 表型證據(jù) – 分子生物學(xué)證據(jù) ? 轉(zhuǎn)基因生物的完整鑒定還需要提供以下證據(jù) – 轉(zhuǎn)化體當(dāng)代性狀表現(xiàn)的證據(jù)（如抗蟲、抗病等） – 轉(zhuǎn)化體表型性狀遺傳的證據(jù) ? 有性繁殖作物應(yīng)能傳遞到后代 ? 無(wú)性繁殖作物繁殖一代應(yīng)穩(wěn)定遺傳 – 以上各方面均要求設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照 轉(zhuǎn)基因的遺傳 一、轉(zhuǎn)基因的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)對(duì)其功能表達(dá)及遺傳的影響 二、轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性 三、轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)化植株中的遺傳傳遞規(guī)律 四、轉(zhuǎn)化方法對(duì)整合的外源基因結(jié)構(gòu)及遺傳特性的影響 1. 轉(zhuǎn)基因整合特點(diǎn) 2. 轉(zhuǎn)基因整合的遺傳效應(yīng) 3. 轉(zhuǎn)基因沉默 一、轉(zhuǎn)基因的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)對(duì)其功能表達(dá)及遺傳的影響 轉(zhuǎn)基因整合的遺傳效應(yīng) ? 位置效應(yīng) 外源基因插入拷貝數(shù)相同但由于插入位置不同而造成該基因表達(dá)量不同的現(xiàn)象稱為位置效應(yīng) ? 同源基因的共抑制效應(yīng) 插入的外源基因與植物基因組內(nèi)部的產(chǎn)生基因同源共抑制效應(yīng) 插入的外源基因之間的同源共抑制效應(yīng) ? 外源基因重排 同源基因的異位配對(duì)造成寄主染色體重排 轉(zhuǎn)基因沉默 ? 位置效應(yīng) ? 基因及啟動(dòng)子的甲基化 ? 重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默 ? 同源基因的共抑制效應(yīng) 甲基化導(dǎo)致 基因沉默 ? 甲基化 當(dāng)一個(gè)或多拷貝基因整合進(jìn)入或接近高甲基化基因組序列時(shí)，轉(zhuǎn)基因的順式失活就可能發(fā)生。 洗片時(shí)可以使用 X光片自動(dòng)洗片機(jī)。 加入稀釋好的二抗，室溫或 4℃ 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。 洗滌 3次。 加入稀釋好的一抗，室溫或 4℃ 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。對(duì)于一些背景較高的抗體可以在 4℃ 封閉過(guò)夜。 Western Blot詳細(xì)過(guò)程 ? 蛋白提取 ? SDSPAGE電泳 ? 轉(zhuǎn)膜 ? 雜交過(guò)程 ? 顯示結(jié)果： NBT/BCIP 堿性磷酸酶標(biāo)記 DAB 辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記 熒光掃描儀 電泳示意圖 返回 返回 Western Blot步棸 封閉 (Blocking) 轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的 Western洗滌液中，漂洗 12分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。 42℃ 雜交過(guò)夜。 2．雜交 倒出預(yù)雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至 42℃ 的雜交液，同樣加入變性的鮭魚精DNA。繼續(xù)雜交 4hr。放入 42℃ 雜交爐中，使雜交體系升到 65℃ 。 ? 六、 Southern 雜交一般采取的是液 固雜交方式，即探針為液相，被雜交 DNA為固相 。室溫或 37℃ 1hr。 以下為 Promega公司隨機(jī)引物試劑盒提供的標(biāo)記步驟： 1．取 2550ng模板 DNA于 ， 100℃ 變性 5min，立即置冰浴。 ? 五、探針標(biāo)記 進(jìn)行 Southern 雜交的探針一般用放射性物質(zhì)標(biāo)記或用地高辛標(biāo)記。） 4. 轉(zhuǎn)移結(jié)束后取出 NC膜，浸入 6 SSC溶液數(shù) min，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間， 80176。注意在膜與膠之間不能有氣泡。 :將凝膠轉(zhuǎn)移到中和液 15min。 檸檬酸三鈉 ， NaOH 調(diào) pH 至 ，加ddH2O至 1000ml。 ２．中和液： 1M TrisHCl(pH )； NaCl。 12V/cm， DNA從負(fù)極泳向正極。 1. 制備 %凝膠：一般用于 Southern雜交的電泳膠取 %。一般 Southern雜交每一個(gè)電泳通道需要 1030μg的 DNA。 8 用 400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入適量的滅菌 ddH2O或 TE溶解 DNA。 7 氯仿抽提后，加 2V乙醇， 20℃ 沉淀 30 min 。 5 12 000rpm離心 10min回收 基因組 DNA沉淀，吹干后加入適量的滅菌 ddH2O或TE溶解 DNA。 3 加入 150μL 5mol/L KAc，混勻，置冰上 2030 min。 取幼嫩的組織材料 12g, ，加入液氮研磨至粉末狀，加 500μL提取液的離心管中 ,輕輕混勻。 （ 5）重復(fù)步驟（ 4） 12次，以蛋白層不出現(xiàn)為止； （ 6）取上清， 20℃ 沉淀 1h， 4℃ ， 12023 r/min，離心 10 min； （ 7）棄去上清液，用 70%乙醇洗滌沉淀 2次； （ 8）室溫下干燥后（一般干燥 515 min），溶于 3050 μl去離子水中，于 20℃ 或者 70℃ 下保存?zhèn)溆谩? （ 70℃ 75℃ ）：在 Taq酶（在 72℃ 左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的 5′端 →3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的 DNA鏈。既可用分光光
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