【文章內(nèi)容簡介】 ） 蛋白酶消化法 ? 原 理： 蛋白酶消化可以去除覆蓋在抗原決定簇表面的雜蛋白 ， 更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被酶消化打開而引起暴露抗原決定簇的作用 ， 使第一抗體能與抗原部分結合 ， 提高陽性檢測率 。 ? 注意事項： 用于 IHC切片消化的酶有多種 ， 所選擇酶的種類 、 使用的濃度 、 pH值 、 消化時間及溫度等均要視組織固定的不同 、 所檢測抗原的性質(zhì) 、組織類型的不同而異 ， 通過預實驗確定 。 ? 常用的消化酶類： 胰蛋白酶 和 蛋白酶 K：檢測細胞內(nèi)抗原切片的消化 ， 如 Keratin、 CEA、 GFAP等 。 胃蛋白酶 ：細胞間質(zhì)抗原檢測切片的消化 ， 如纖連蛋白 (fibronectin)， 各型膠原等 。 ? 消化時間及溫度： 一般消化時間與組織固定的長短呈正比 。 蛋白酶的消化時間 5~10~20min，視切片固定時間的長短而定 。 （ 3） 酶消化液的配制 除了商業(yè)銷售的成品 ， 可按說明書使用外 ， 還可自行配制 。 ① % 胰蛋白酶 胰蛋白酶 % 氯化鈣 (pH ) 100 ml 配制方法： 先配制 %的 CaCl2， 用 NaOH將其 pH調(diào)至 ， 然后加入胰蛋白酶 ，溶解之 。 用前將胰蛋白酶液過濾 ， 并在水浴中預熱至 37℃ ， 室溫下消化時間 5~30min， 多用于細胞內(nèi)抗原的暴露 。 。 ② % 胃蛋白酶 胃蛋白酶 400 mg HCl 100 ml 多用于間質(zhì)組織免疫組化染色切片的消化 ， 37℃ 下消化時間約 30 min。 ③ % 蛋白酶 K 蛋白酶 K g () 100 ml 用法同上 。 在免疫組化染色中 ， 有時經(jīng)過度固定的標本 ， 影響一抗與抗原的結合 ， 用蛋白酶溶液消化 ， 起到暴露抗原部分的作用 。 消化時間應根據(jù)不同組織而異 。 總之 ， 在保持組織形態(tài)不破壞的前提下 ， 宜盡量消化時間延長 。 以上三種酶消化液 ，以第一種最為常用 。 9. 經(jīng)熱修復抗原或蛋白酶消化的切片經(jīng)洗滌后進行下一步 。 10. 用與制備二抗相同的動物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特異性吸附 。 ? 組織中非抗原抗體反應出現(xiàn)的陽性染色稱為 非特異性背景染色 。 ? 最常見的原因是蛋白 (第一抗體 ) 吸附于高電荷的膠原和結締組織成分上 。 ? 最有效的方法是在用第一抗體孵育切片前 ， 用與制備第二抗體相同動物的非免疫血清封閉組織上帶電荷基團 ， 而除去與第一抗體的非特異性結合 (在室溫下進行 )。 ? 非免疫血清的稀釋度 1:5~1:20， 還可加入 BSA (bovine serum albumin) 使稀釋后的非免疫血清中含 ~6%的BSA， 可取得更佳的染色效果 ， 阻止非特異性背景染色 。該方法是減少非特異性背景染色的有效方法 。 11． 用特異性一抗孵育切片 研究組織細胞中的某種抗原是否存在 ， 應用免疫組化染色 ， 就要選用針對這種抗原的特異性抗體 。 現(xiàn)在國際上有許多公司生產(chǎn)免疫組化試劑 ， 包括一抗 、 二抗 、 顯色劑 ， 并制成了成套的試劑盒 ， 但一般試劑盒中不包括一抗 ， 研究者可根據(jù)一抗的種屬性 ， 選擇含有與一抗相匹配的二抗的試劑盒 。 ① 一抗的種屬來源 一抗可來源于各種種屬的動物 ， 常見是來自家兔 、 山羊或小鼠 ， 偶見來自馬 。 一般來自家兔和山羊的一抗都是多克隆的 IgG抗體 ， 而來自小鼠的多是單克隆的 IgG抗體 。 根據(jù)實驗動物或標本種屬的不同 ， 選擇針對大鼠 、 小鼠或人的抗體 。 ② 抗體劑型及滴度檢驗 我國現(xiàn)在使用的多數(shù)抗體等試劑是由國外進口 ， 包括一抗和含二抗的試劑盒 。 ? 國外生產(chǎn)的一抗一般濃度都是 100200?g/ml， 但國內(nèi)各經(jīng)銷商將進口的原裝抗體又進行了分裝 ， 如分成 ，也經(jīng)銷 1ml/瓶抗體 ， 價格各不相同 。 ? 國內(nèi)各經(jīng)銷商又根據(jù)需要將進口抗體進行稀釋 ， 銷售的品種又分為 即用型 和 濃縮型 (進口原裝的抗體 )兩種 。 ? 在免疫組化染色中 ， 使用即用型一抗和試劑盒一般不需稀釋 ，直接在切片上滴加即可 。 ? 濃縮型必須在稀釋后才能使用 ， 因為濃縮型抗體濃度高 ， 可引起嚴重的非特異性染色 ， 因此 ， 必須在正式染色前先用切片對不同滴度的抗體染色效果進行評價 ， 選擇濃度強度最好 ，非特異性反應 （ 背景染色 ） 最低的抗體稀釋度來進行正式染色 。 一抗稀釋滴度的評價 （摸索實驗條件時可以稀釋度跨度大一些試） 切片編號 slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5 抗體稀釋度 1: 50 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 特異性染色 + + + + + + + + + + + + + + + 背景染色 + + + + + – – ③ 一抗體的稀釋 一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同 ， 即 PBS pH ， 為進一步保證減少背景染色 ， 用于稀釋一抗的 PBS中也應加入制備二抗的同種動物的非免疫正常血清 ， 有條件的還可加入 BSA， 兩者的濃度在 125% 即可 。 ④ 一抗的孵育時間及條件 加入適當稀釋的一抗的切片 ， 可在常溫下或 37℃ 下保溫盒內(nèi)孵育 。 經(jīng)過正常二抗同種動物非免疫血清孵育后的切片不能用 PBS洗滌 ， 在去除多余的非免疫血清后 ， 直接向切片上滴加稀釋好的第一抗體 。 孵育時間： 3060分鐘或更長 。 如果待檢的抗原量很少 ， 而增加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色 ， 可增加一抗的稀釋倍數(shù) ， 將切片放在保濕盒中置于 4℃ 冰箱內(nèi)過夜孵育 ， 可達到滿意的效果 。 12． PBS洗滌切片 將用一抗孵育后的切片用 PBST洗滌 3次 ， 每次 5min， 用冷 PBS洗滌 ， 可減少非特異性反應 。 13． 用針對一抗的生物素化二抗孵育切片 根據(jù)一抗的種屬來源 ， 選擇相應的二抗 。 如：一抗是家兔抗某種抗原抗體 ， 二抗一般選用山羊抗家兔 IgG抗體 。 二抗分濃縮型和即用型兩種 。 即用型二抗不需稀釋 ， 直接使用 。濃縮型者一般用 PBS直接以 1: 200 400倍稀釋使用 ， 室溫下保濕盒內(nèi)孵育 3060min。 試劑盒：濃縮型或即用型 SP試劑盒 、 ABC試劑盒 試劑盒中包含： 內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑 二抗的同種動物非免疫血清 生物素標記的抗 IgG抗體 （ 二抗 ） SP試劑 [ABC試劑 （ 單獨購買 ） ] 14． PBS洗滌切片 5min 3次 15． 滴加 SP試劑或 ABC試劑 （ 1） 生物素 抗生物素染色 （ SABC或 SP法 ） 的顯色原理 ? ABC法的染色原理 很早以前研究者就注意到給動物飼以大量的雞蛋白 ，會引起明顯的 “ 維生素 H 缺乏癥 ” ， 也稱為 “ 蛋白質(zhì)傷害 ” 。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) ， 在雞蛋白中含有一種堿性蛋白 ， 分子量為 68 kD， 屬于糖蛋白 ， 當時命名為 卵白素（ avidin） 。 機體中還有一種物質(zhì)叫維生素 H， 又稱為 生物素 （ biotin） ， 是一種小分子的維生素 ， 廣泛分布于動植物組織中 ， 以輔酶的形式參與各種羥化酶反應 ， 分子量為 244 D。 卵白素具有 4個同 Vitamin H（ 生物素 ） 親和力極高的結合點 。 給動物飼以大量的雞蛋白所致的維生素 H缺乏 ， 就是由于卵白素和大量維生素 H結合所致 。 研究者根據(jù)這兩種物質(zhì)的特點 ， 提出了卵白素 生物素免疫染色系統(tǒng) 。 由于習慣上將維生素 H稱為生物素 ， 為便于理解 ， 我國免疫細胞化學作者將卵白素稱為抗生物素或親和素 ， 因此卵白素 生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為 抗生物素 生物素免疫染色法 。 生物素的另一特點是它可以和抗體 IgG的 Fc段結合 ， 不影響 IgG的活性 。 同時 ， 生物素經(jīng)活化后還可同過氧化物酶或 ALP等結合 ， 而不影響酶的活性 。 根據(jù)上述這些抗生物素 生物素的反應原理和特性 ， 1981年許世明設計出了免疫組織化學染色的 ABC法 （ avidinbiotin peroxidase plex method， ABC ） ， 并已制成了商品化的試劑盒 。 ABC法免疫組化的試劑盒中除包括制備二抗的同一種屬動物的非免疫血清 、 生物素標記的二抗外 ， 還包括： A試劑 (抗生物素 ) 和 B試劑 (生物素 過氧化物酶復合物 )。 在使用前半小時 ， 將兩種試劑按說明書要求相互混合 ， 形成復合物 ， 一般是在 5ml 的 PBS中加一滴 A試劑 (約 50?l)， 混勻后再加一滴 B試劑 (約 50?l)， 混勻 ， 半小時后加至經(jīng)過生物素標記的二抗孵育的切片上 ， 室溫下保濕盒內(nèi)孵育 3060 分鐘 。 ? SP 法的染色原理 基本原理與 ABC法相似 ， 但與 ABC法稍有不同 ， 是采用生物素標記的第二抗體與 鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶 及基質(zhì)素混合液來測定細胞和組織中的抗原 。 Biotinylated second antibody PO PO PO PO Antigen Biotin Avidin HRP Primary antibody Illustration of ABC method Avidinbiotinperoxidase plex Ag Ag Biotin Streptavidin Enzyme: HRP or AP Primary antibody Biotinylated secondary antibody Illustration of SP method SP plex ? SABC 法的染色原理及特點 (1) 基本原理 鏈酶親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì) ，分子量 60kD， 不含糖鏈 ， 等電點 PI 。 與親和素相同也有四個生物素結合點 ， 親和力極高 。 與親和素相比是一種更近于完美的生物素結合蛋白 。 鏈酶親和素同一定濃度的生物素化酶混合后 ， 就能形成鏈酶親和素 生物素 酶復合物 。 這種復合物中至少存在一個尚未被生物素占據(jù)的親和素結合位點 ， 可以和各種生物素標記的抗體結合 。 這種復合物即是 SABC (strept avidinbiotin plex)。 (2) SABC的特點 ? 高敏感性； ? 低背景； ? 簡便快速； ? 結果穩(wěn)定 ? EnVison?系統(tǒng)染色原理 ? 與 ABC法 、 SP法及 SABC法的染色原理均不同 ， 是將二抗與多聚螯合物酶 （ HRP或 AP） 通過化學方法連接在一起 ， 形成多聚螯合物 ， 在多聚螯合物上含有大量的酶分子和二抗 ， 因此 ， 比 ABC法 、 SP法和 SABC法具有更顯著的放大作用 ， 可高出幾十倍 。 由于多聚物在人或動物體內(nèi)不存在 ， 因此 ， 無非特異性染色 ， 背景著色極輕 。 ? 染色步驟簡便 ， 在一抗反應后 ， 切片經(jīng) PBS洗滌后即可加入 EnVison?系統(tǒng)試劑 ， 再經(jīng) PBS洗滌后 ， 可進行顯色 。 Ag Ag Primary antibody Secondary antibody Enzyme, AP or HRP Illustration of EnVision method