染色質(zhì)免疫沉淀(編輯修改稿)
2025-09-11 22:24 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 熱，然后摸索不同的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可以使大部分基因組 DNA斷裂成 2001000bp大小。需要注意的是每次的超聲體積和細胞用量宜固定，否則就不能使用一個相對比較固定的超聲條件用于后續(xù)實驗。 ③ 酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別 Micrococcal Nuclease可以將染色質(zhì)切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結(jié)果更精致，更均一。另外，酶反應(yīng)的條件比較溫和，對 DNA和DNA蛋白復(fù)合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質(zhì)適用于新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時，經(jīng)常采用沒經(jīng)過甲醛固定的 Native ChIP（ NChIP）的研究方法。因為 NChIP沒經(jīng)過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和 DNA的結(jié)合，所以只能選擇酶處理染色質(zhì)的方法。對于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。 Millipore公司有商品化的 Micrococcal Nuclease處理的 ChIP試劑盒（ EZEnzyme）提供。 Enzyme和 sonication處理結(jié)果比較 超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實驗組可采用不同的超聲波處理條件，比較剪切效果。按以下步驟操作比較各種條件下的剪切效果： a. 將超聲處理過的樣品離心收集上清（ 4℃ 13000rpm離心 10分鐘），加入 10μl M EDTA、 20μl 1M TrisHCl 、 2μl 20mg/ml蛋白酶 K， 45℃ 孵育 小時； b. 酚 /氯仿抽提 一次，乙醇沉淀并重溶于 20μl的 ddH2O中， % 瓊脂糖凝膠電泳檢查。 實驗組 1 2 3 4 5 6 7 8 超聲次數(shù) 3 6 9 11 3 6 9 11 超聲功率 15W 15W 15W 15W 25W 25W 25W 25W 酚 /氯仿抽提步驟 按照 1： 1體積比加酚 /氯仿充分混勻后離心，取上層水相至新管，加入 1/10體積 3M Nacl， 2倍體積無水乙醇，大轉(zhuǎn)數(shù)離心 5min 5. 將超聲處理過的樣品在 4℃ 13000rpm離心 10分鐘收集上清， 10倍稀釋，將其移入一新的 2ml EP管中； 6. 按照每 2ml稀釋后液體加入 75μl的比例加入 蛋白 A瓊脂糖
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