【文章內(nèi)容簡介】 技術(shù)；發(fā)展高效、高靈敏的聯(lián)用技術(shù)，如 LCMS，CZEMS；分析過程自動(dòng)化或智能化，以提高分析效率，降低成本。 隨著分子生物學(xué)和分子化學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)病原微生物的鑒定已不再局限于對(duì)它的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性等一般檢驗(yàn)上，而是從分子生物學(xué)上研究生物大分子，特別是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分。由于ＰＣＲ技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，因而發(fā)展迅速，應(yīng)用范圍越來越廣。不僅用于基因表達(dá)調(diào)控、基因克隆與測(cè)序、制備特異探針、特異基因篩選、等基礎(chǔ)研究，而且在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品科學(xué)、環(huán)境科學(xué)及考古學(xué)等領(lǐng)域得到了實(shí)際應(yīng)用。 ? 原理： PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡稱。是依據(jù) DNA模板的特點(diǎn)，模仿體內(nèi)的復(fù)制過程，在體外適合條件下，以單鏈 DNA為模板，以人工設(shè)計(jì)與合成的寡核苷酸為引物，利用熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶５ ’3’ 方向摻入單核苷酸來特異性地?cái)U(kuò)增 DNA片段的技術(shù)。 ? 步驟 ：整個(gè)反應(yīng)過程通常有20~40個(gè) PCR循環(huán)組成，每個(gè)PCR循環(huán)有高溫變性 — 低溫負(fù)性 — 適溫延伸三個(gè)步驟組成。高溫時(shí)， DNA變性，氫鍵打開，雙鍵變成單鍵，作為 DNA擴(kuò)增的模板；低溫時(shí)，寡核苷酸引物與單鏈 DNA模板特異性地互補(bǔ)結(jié)合即復(fù)性；然后在適宜的溫度下， DNA聚合酶以單鏈 DNA為模板，延 5’ 向 3’ 方向摻入核苷酸，使引物延伸合成模板的合成鏈，經(jīng)過多個(gè)變性 — 復(fù)性 —延伸的 PCR循環(huán)，就使得 DNA片段得到有效的擴(kuò)增。 1）用于食品樣品中致病菌的檢測(cè) ? PCR技術(shù)與傳統(tǒng)檢測(cè)食品中致病菌的方法相比，可用 PCR擴(kuò)增其相應(yīng)的 DNA片段，來快速、靈敏地檢測(cè)樣品中是否存在某些細(xì)菌或致病菌，尤其是那些人工無法培養(yǎng)的微生物。 ? PCR反應(yīng)體系包括 4各要素： 核苷酸單體、能結(jié)合上 DNA的酶、靶 DNA和引物。 ? 利用 PCR檢測(cè)食品中的致病菌， 首先要抽提靶DNA，通過離心或過濾的方法可以從樣品中獲得細(xì)菌細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解，進(jìn)行核酸純化，使其適合做 PCR。用 PCR儀可以使 DNA鏈在短短幾個(gè)小時(shí)增加到幾百萬個(gè)。 PCR技術(shù)在食品檢測(cè)過程中已受到廣泛的關(guān)注，雖然還僅僅是起步，但其前景看好。 2）用于生活飲用水中指示細(xì)菌的檢測(cè) ? 水質(zhì)的檢測(cè)是以檢測(cè)大腸桿菌和人類糞便中污染的大腸桿菌為依據(jù)。 ? 傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是將細(xì)菌和要檢測(cè)的能利用乳糖的革蘭氏陰性菌一起培養(yǎng)，檢測(cè)方法繁瑣，需花費(fèi)幾天時(shí)間。 ? 若根據(jù)大腸桿菌類能利用 β 半乳糖苷酶，采用明確的底物進(jìn)行檢測(cè)，則可以更加迅速地檢測(cè)到大腸桿菌類。然而有一些大腸桿菌品系并不表達(dá) β 葡萄糖醛酸苷酶（ u id），因此偶爾也會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)的失敗。而 PCR技術(shù)為檢測(cè) β 半乳糖苷酶（ L ac）和 β葡萄糖醛酸苷酶基因提供了一個(gè)更加靈敏和特異性更強(qiáng)的方法。通過 PCR擴(kuò)增 l ac Z和 u id A基因，即可分別檢驗(yàn)出水樣中大腸桿菌類和大腸桿菌。 ? 一般用擴(kuò)增的 l ac Z作為活體選擇培養(yǎng)方法能檢測(cè)同種大腸桿菌類，用擴(kuò)增的 u id A 則能夠檢測(cè)出一種大腸桿菌和志賀氏菌屬，而且對(duì)那些 u id A表型為陽性的大腸桿菌和志賀氏菌，用 PCR方法也能檢測(cè)出來，因而 PCR方法更加靈敏。此外，由于 PCR反應(yīng)能夠在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，故水源在使用前利用 PCR來檢測(cè)指示細(xì)菌安全性更高。 3）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè) ? 轉(zhuǎn)基因食品是利用基因重組技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其他物種中，改變生物的遺傳物質(zhì)，使其在性狀、營養(yǎng)物質(zhì)和品質(zhì)等方面朝著人類需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變，獲得全新特性的生物。包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、植物、微生物。以轉(zhuǎn)基因生物為直接食品或原料加工生產(chǎn)的食品即為轉(zhuǎn)基因食品 。 ? 基于特異性 DNA片段的 PCR檢測(cè)技術(shù)，特異性DNA片段包括外源啟動(dòng)子、終止子、報(bào)告基因和目的基因。一般來說， PCR法可將食品中殘存的 DNA增幅到 100萬倍以上，檢出靈敏度高，但操作不當(dāng)易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。 ? PCR定性篩選檢測(cè)方法的一般程序： ① 提取食品中的 DNA ② 設(shè)計(jì)與待測(cè)特異 DNA片段相適的引物 ③ 對(duì)待測(cè) DNA片段進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ④ 用瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增的 DNA片段， EB染色后，分析鑒定轉(zhuǎn)移基因成分。 ? PCR定性檢測(cè)假陽性結(jié)果的消除 。 由于 PCR技術(shù)比較嚴(yán)格，高靈敏性以及實(shí)驗(yàn)室的遺留污染，在日常的轉(zhuǎn)基因食品中常出現(xiàn)假陽性結(jié)果。目前在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中主要以CaMV35S啟動(dòng)子和 NOS終止子作為檢測(cè)目標(biāo)，來判斷食品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。 ? 多重 PCR法 多重 PCR法可同時(shí)針對(duì)幾個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行 PCR檢測(cè)技術(shù)。應(yīng)用多重 PCR技術(shù)同時(shí)對(duì) 35S和 NOS進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)不僅提高了效率，而且由于是對(duì)雙組份同時(shí)檢測(cè)，其結(jié)果也更為可信。 ? PCR檢測(cè)方法 目前國外較為成熟的方法主要有：定量競(jìng)爭PCR和實(shí)時(shí) PCR法 定量檢測(cè)方法的實(shí)用性 :各國轉(zhuǎn)基因食品管理法相繼出臺(tái)，對(duì)標(biāo)簽制度要求的轉(zhuǎn)基因成分的最低限量有所規(guī)定，因而定量檢測(cè)較定性檢測(cè)更顯的必要。但是目前的定量檢測(cè)方法很少對(duì)技術(shù)和儀器設(shè)備要求很高，難以推廣。 ? 基因芯片 又稱 DNA/c DNA芯片或 c DNA微陣列 。 ? 基因芯片技術(shù)原理： 是根據(jù)分子生物學(xué)中成熟的核酸分子原位雜交技術(shù)，即 DNA的堿基配對(duì)和序列互補(bǔ)原則，將大量探針分子固定于大約 1㎝ 2大小的芯片上，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱判定樣品中靶分子的數(shù)量。 ? 基因芯片技術(shù)可分解為４各主要部分： ＤＮＡ陣列的構(gòu)建和印制、探針靶的制備、雜交和檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集與分析。 ? 特點(diǎn)： 此技術(shù)可以對(duì)大量的 DNA或ＲＮＡ分子進(jìn)行檢測(cè)分析，大大提高檢測(cè)效率和精確性。該方法整個(gè)過程僅需４～６小時(shí)，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于大豆、馬鈴薯、玉米等作物及食品的檢測(cè)與驗(yàn)證。 ? 存在的問題 ： 首先是基因高效擴(kuò)增易造成ＰＣＲ產(chǎn)物的交叉污染；其次是不能進(jìn)行基因定量檢測(cè)。 DNA探針實(shí)質(zhì)上一種具有單一螺旋結(jié)構(gòu)的 DNA ，其核酸通過堿基對(duì)可以同具有互補(bǔ)順序的另一條多核苷酸（靶 DNA ）雜交。 ? 其方法 就是在探針和靶 DNA之間堿基配對(duì)基礎(chǔ)上個(gè)建立起來的基因方法。它能為食品生產(chǎn)過程的控制、衛(wèi)生管理、防止交叉污染、原始材料及中間產(chǎn)品的及時(shí)處理等提供有力的信息保證。 ? DNA探針使用方法分為 3類： 第一類：短針法。 如果 DNA靶序列已知，就可以用自動(dòng)化學(xué)分析法將要判定的 DNA多核苷酸互補(bǔ)、標(biāo)識(shí)。 第二類是應(yīng)用于總的胞內(nèi) DNA探針法。 這種方法要先提取然后用生物化學(xué)方法標(biāo)識(shí)，它一般不能用于區(qū)別相似的、關(guān)系密切的生物，因?yàn)樗鼈兙哂性S多相似的 DNA序列。 上述兩種方法都比較簡單，費(fèi)用也相對(duì)比較便宜。 ? 第三類方法是采用 DNA重組克隆技術(shù)。 其基本過程是首先將 DNA從由酶重組后的目標(biāo)物中提取出來，然后進(jìn)行克隆，當(dāng)他們大量繁殖后即被收集起來標(biāo)識(shí)，在篩選出目標(biāo) DNA，已決定雜交關(guān)系。 ? 采用克隆雜交法進(jìn)行微生物分析的步驟為 : ① 讓細(xì)菌在有瓊脂的培養(yǎng)皿上形成克隆體； ② 無菌膜復(fù)制在皿上，從克隆體中獲取細(xì)胞形成替代皿； ③ 設(shè)法將膜上的細(xì)胞 DNA雙螺旋鏈打開，釋放出單一 DNA鏈，然后 DNA鏈被固定； ④ 與 DNA探針互補(bǔ)配對(duì)，具有靶序列的微生物馬上可被鑒別、計(jì)數(shù)。 DNA探針、 DNA芯片技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用已成為新的研究領(lǐng)域。這種高新技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化還需要大量的時(shí)間和大量的資金投入。隨著我國對(duì)高新技術(shù)的重視和投入的加大， DNA探針和DNA芯片技術(shù)將會(huì)普遍應(yīng)用于食品生產(chǎn)、商品流通、質(zhì)量監(jiān)督、海關(guān)商檢等領(lǐng)域部門中的食品安全監(jiān)測(cè)，針對(duì)生產(chǎn)中的育種、防蟲、提高產(chǎn)品質(zhì)量的高效和專一的 DNA探針也會(huì)很快面世。 食品污染與控 ? ? 生物性污染是指微生物、寄生蟲、昆蟲等生物對(duì)食品的污染。在食品的加工，儲(chǔ)存，運(yùn)輸、銷售直到食用整個(gè)過程中，每一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能受到生物污染，危害人體健康。 微生物污染的來源、分類及危害 1).食品污染的分類： 2）污染食品的危害： 3）食品污染途徑 （ 1）原輔料污染。 ? （ 2）生產(chǎn)加工過程污染 ? （ 3）包裝、儲(chǔ)存、銷售中污染。 ? （ 4）人為污染 ? （ 5）意外污染 細(xì)菌性污染 細(xì)菌是單細(xì)胞原核生物，根據(jù)其形態(tài)分為球菌，桿菌和螺旋菌。再根據(jù)其大小、排列方式、內(nèi)部構(gòu)造和生理、生態(tài)等特征加以區(qū)分。 用細(xì)菌制造食品帶來有益方面，但是也有無益方面。 1）引起食物中毒的細(xì)菌： 沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，志賀氏菌，大腸桿菌等 2）細(xì)菌引起的人畜共患病 在脊椎動(dòng)物與人之間自然傳播的疾病和感染稱為人畜共患病。如 :炭疽病、結(jié)核病、布氏桿菌病等。 沙門氏菌 志賀氏菌 ? 真菌及其毒素的污染 真菌是微生物中的高級(jí)生物，它們既有無性繁殖器官（無性孢子），還具有有性繁殖器官（有性孢子），在自然界中廣泛存在。 一些真菌廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，如釀酒、制漿、面包制造等。但有些真菌也通過食品給人體的健康帶來危害。 1）霉菌與食物中毒 霉菌是一些絲狀真菌的通稱。凡是生長在營養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀菌絲的真菌。 ? 2)防止霉菌毒素中毒的措施 1，選用抗病品種 2，作物收獲時(shí)要及時(shí)曬干 、脫粒 3，糧食的儲(chǔ)存管理 4，食品加工前應(yīng)測(cè)定毒素 含量 5，不吃霉變食品 3）真菌引起的人畜共患病 1，新型隱球酵母菌 2，莢膜組織胞漿菌病 3，曲霉菌病 4，假絲酵母病 化學(xué)物質(zhì)污染及其控制 1）基本概念 （ 1） 獸藥 ： 用于預(yù)防、治療、診斷畜禽等動(dòng)物疾病，有目的地調(diào)節(jié)生理機(jī)能并規(guī)定作用、用途、用法和用量的物質(zhì) （ 2） 獸藥殘留 ： 食品動(dòng)物用藥后，任何可食動(dòng)物源性產(chǎn)品中含有的原型藥物或其代謝產(chǎn)物以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)的殘留。 （ 3） 殘留總量 ： 指對(duì)食品動(dòng)物用藥后，任何可食動(dòng)物源性產(chǎn)品中某種藥物殘留的原型藥物或全部代謝產(chǎn)物的總和。 （ 4） 最大殘留限量 ： 對(duì)食品動(dòng)物用藥后產(chǎn)生的允許存在于食物表面或內(nèi)部的該獸藥殘留的最高量 /濃度 （ 5） 休藥期： 又稱停藥期。食品動(dòng)物用藥后產(chǎn)生的允許存在于食物表面或內(nèi)部的該獸藥殘留的最高量 /濃度。 （ 6） 動(dòng)物飼料添加劑 ： 指預(yù)防、治療動(dòng)物疾病而摻入載體或者稀釋劑的獸藥的預(yù)混料，包括抗球蟲藥類、驅(qū)蟲劑類、抑菌促生長類等 2） 食品中獸藥殘留的來源與原因 （ 1）畜禽防病治病用藥 （ 2）飼料添加劑中獸藥的使用。為了預(yù)防某些動(dòng)物疫病，在飼料中常常人為地加入一些藥物 （ 3）食物保鮮中引入藥物。 （ 4）無意帶入的污染。 3）主要獸藥殘留對(duì)人體的危害 。 包括抗生素和合成抗菌藥物，主要用于防止動(dòng)物傳染性疾病和改進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)性能。在畜牧、家禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素的使用十分普遍。 (1) 毒性、致敏性與超過敏反應(yīng) 。 抗生素和磺胺類殘留造成牛奶和食品的污染可以對(duì)人體引起有害的過敏反應(yīng) （ 2）增加革蘭氏陰性桿菌的致病性 。 若長期使用抗生素作為畜禽飼料藥物添加劑，可以使某些細(xì)菌菌株突變?yōu)槟退幘辏瑢?duì)抗生素有抗性。 （ 3） 改變腸道菌群的微生態(tài)環(huán)境 。 抗生素的使用，不僅是人畜腸道中具有抗生素抗性的細(xì)菌增加，同時(shí)可以殺滅或 B. 抗寄生蟲劑 是指能夠殺滅或驅(qū)除體內(nèi)、體外寄生蟲的藥物，包括驅(qū)蟲劑和抗球蟲劑等。 我國還使用某些有機(jī)磷農(nóng)藥（如敵百蟲、敵敵畏、哈羅松、驅(qū)蟲磷等）可以用于動(dòng)物飼養(yǎng)中舍中殺蟲。但這也可能同時(shí)造成動(dòng)物性食品的有機(jī)磷殘留和其他農(nóng)藥殘留問題。 促生長激素，人工合成的、具有同化作用的增強(qiáng)劑。 （ 1）禁止使用的獸藥、在飼料中添加的治療藥物。 （ 2）允許使用的獸藥和飼料添加劑必須遵守安全休藥期