tan第五章目的基因的導(dǎo)入和重組子的篩選(編輯修改稿)
2025-01-30 16:59 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 大小 重組 DNA純度、濃度 1/30/2023 22 歡迎同學(xué)們聽課！ 重組 ?噬菌體 DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌 ? 轉(zhuǎn)染 (transfection)： 采用與質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞相似的方法 ，將重組 ?噬菌體 DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過(guò)程 ， 稱為轉(zhuǎn)染 。 效率較低 ， 103～ 104個(gè)噬菌斑 / ?g DNA ， 較難滿足一般實(shí)驗(yàn)要求 ， 實(shí)踐中少用 。 ? 轉(zhuǎn)導(dǎo) (transduction)： 是指通過(guò) ?噬菌體 （ 病毒 ） 顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源 DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程 。 效率高 ， 可達(dá) 103～ 104個(gè)噬菌斑 / ?g DNA， 需進(jìn)行體外包裝 。 1/30/2023 23 歡迎同學(xué)們聽課！ ? 體外裝配（ in vitro packaging） ： λ DNA的轉(zhuǎn)染效率不高，如果將重組的 λ分子裝配成頭 尾結(jié)構(gòu)的病毒粒子，將極大的提高效率。 1/30/2023 24 歡迎同學(xué)們聽課！ 噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法 1/30/2023 25 歡迎同學(xué)們聽課！ 噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法 1/30/2023 26 歡迎同學(xué)們聽課！ λ 噬菌體的體外裝配 ? 有兩種不同的系統(tǒng)可以應(yīng)用： 一種是 cos位點(diǎn)突變的噬菌體的單品系系統(tǒng)。 另一種系統(tǒng)需要兩種不同的缺陷品系一個(gè)是基因 D的突變體，另一個(gè)品系是基因 E的突變體，由于蛋白質(zhì)合成的缺陷。體外的裝配過(guò)程可以利用兩種不同培養(yǎng)物的混合物，含有完整的外殼蛋白，完成裝配過(guò)程。將裝配的噬菌體接入細(xì)菌就可以完成正常的侵染過(guò)程。 1/30/2023 27 歡迎同學(xué)們聽課！ λ 噬菌體體外裝配的兩種系統(tǒng) 1/30/2023 28 歡迎同學(xué)們聽課！ 噬菌斑 ? λ 和 M13噬菌體都能形成噬菌斑， λ 形成的是真正的噬菌斑 (透明 )，是由于細(xì)胞的裂解引起的；而 M13的噬菌斑是渾濁的，因?yàn)榧?xì)胞并未裂解，它引起的是細(xì)菌生長(zhǎng)的減慢，而使細(xì)菌的濃度低于周圍細(xì)胞。 1/30/2023 29 歡迎同學(xué)們聽課！ 重組噬菌體的鑒定 ? （一）利用插入失活鑒定 M13噬菌體，多種 λ噬菌體載體都含有 lacZ’基因，可以通過(guò)插入失活鑒定重組噬菌體。 （二） λ噬菌體的 cI基因的插入失活 λ噬菌體載體在 cI基因位點(diǎn)上含有單一的酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)上插入外源基因可以導(dǎo)致該基因的失活，引起表現(xiàn)型的變化。 正常的噬菌斑是渾濁的，但重組的噬菌斑是清亮的 。 （三）利用 Spi(sensitive to P2 inhibition)表型選擇 一般來(lái)講， λ噬菌體不能侵染已被 P2噬菌體侵染 的大腸桿菌細(xì)胞，因此 λ噬菌體被稱為 Spi+（對(duì) P2前噬菌體抑制敏感），插入新的 DNA后，能變成 spi，可以侵染含有 P2噬菌體的細(xì)菌， 只有重組子是 Spi可以形成噬菌斑 ，因此可以很方便的選擇出來(lái)。 1/30/2023 30 歡迎同學(xué)們聽課！ ? （四）根據(jù) λ基因組的大小篩選 λ裝配系統(tǒng)，只有 37kb52kb的 DNA分子可以進(jìn)入頭部結(jié)構(gòu)，小于 37kb的不能裝配。許多構(gòu)建的 λ載體切除了部分 DNA，因而小于 37kb，只有插入外源 DNA分子后才能被裝配到頭部結(jié)構(gòu)中，使載體的長(zhǎng)度等于或大于 37kb。對(duì)于這樣的 λ噬菌體載體，只有重組的噬菌體才能進(jìn)行正常的復(fù)制。 1/30/2023 31 歡迎同學(xué)們聽課！ 利用 lacZ39?；虻牟迦胧Щ詈Y選重組噬菌斑 1/30/2023 32 歡迎同學(xué)們聽課！ 重組 DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞 ? 重組 DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞－ 植物基因工程(見后面第八章 ) ? 重組 DNA分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞－ 動(dòng)物基因工程 (見后面第九章 ) 1/30/2023 33 歡迎同學(xué)們聽課！ 重組子篩選的方法 遺傳表型直接檢測(cè)法 依賴重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法 基因表達(dá)產(chǎn)物分析法 DNA序列測(cè)定法 1/30/2023 34 歡迎同學(xué)們聽課！
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