【文章內(nèi)容簡介】 每批抽檢的樣品 (除允許含一定數(shù)量非病原者外 )應(yīng)全部無菌或純凈生長 。 如發(fā)現(xiàn)個別瓶有雜菌或結(jié)果可疑時 ， 可重檢原瓶 (如為安瓶或凍干制品 ， 可重抽樣品 )， 如無菌或無雜菌生長 ， 可作無菌或純粹通過 。 如仍有雜菌 ， 可抽取加倍數(shù)量的樣品重檢 ， 個別瓶仍有雜菌 ， 則作為污染雜菌處理 。 （ 1） 雜菌計數(shù) 每批污染制品至少抽樣 3瓶 ， 用肉湯或蛋白胨水分別作 50倍稀釋 ， 接種于含 4％ 血清及 ％ 血紅素的馬丁瓊脂 (或 )平板上 ， 每個樣品接種平板 2個 ， 臵 36?1?C培養(yǎng) 48小時后 ，再移臵室溫 24小時 ， 數(shù)雜菌菌落數(shù) (CFU)， 然后分別計算雜菌數(shù) 。 任何 1瓶每克被檢樣品 （ 或每頭劑 ） 的非病原菌數(shù)不應(yīng)超過該規(guī)程的規(guī)定 。 如污染霉菌時 ， 亦作為雜菌計算 。 4. 雜菌計數(shù)及其病原性鑒定 （ 2） 病原性鑒定 —— 檢查需氧性細菌 將污染需氧性雜菌管培養(yǎng)物移植 1支 T. G管或馬丁湯 ， 臵同條件下 培養(yǎng)培養(yǎng) 24小時 。 取培養(yǎng)物用蛋白胨水稀釋 100倍 ， 接種體重 1820g的健康小鼠 3只 ， 每只皮下注射 ， 觀察 10天 。 4. 雜菌計數(shù)及其病原性鑒定 （ 2） 病原性鑒定 —— 檢查厭氧性細菌 將生長有雜菌管延長培養(yǎng)至 96小時 ， 取出臵 65?C水浴加溫 30min后移植 1支 ， 在同樣條件下培養(yǎng)24～ 72小時 。 如有細菌生長 ， 將培養(yǎng)物接種體重 350～ 450g的豚鼠之只 ，每只肌肉注射 1m1， 觀察 10天 。 如發(fā)現(xiàn)制品同時污染需氧性及厭氧性細菌 ， 則按上述要求同時注射小鼠及豚鼠 。 4. 雜菌計數(shù)及其病原性鑒定 （ 2） 病原性鑒定 —— 判定 小鼠 、 豚鼠均應(yīng)健活 。 如有死亡或局部化膿壞死 ， 證明有病原菌時 ， 該批制品應(yīng)廢棄 。 4. 雜菌計數(shù)及其病原性鑒定 凡用普通雞胚生產(chǎn)的各種弱毒疫苗 ， 將被檢物用劃線法接種麥康凱平板或 ， 經(jīng) 37?C培養(yǎng) 18～ 24小時后 ，挑選無色半透明 、 邊緣整齊 、 表面光滑并稍突起的菌落 2～ 3個 ， 分別接種于三糖鐵培養(yǎng)基 。 方法是：先在該培養(yǎng)基上層斜面涂布 ， 再穿刺至底部 ， 經(jīng)37?C培養(yǎng) 24小時后 ， 如培養(yǎng)基下層變黃 ， 斜面為淡紅色時 ，要進一步用多價沙門氏因子血清作玻片凝集試驗 ， 如為陽性即證明為沙門氏菌污染 。 除此之外 ， 有些生物制品在需要的情況下 ， 還要進行支原體檢驗和衣原體檢驗 。 5. 禽沙門氏菌的檢驗 （二）安全檢驗 生物制品的安全性是其首要的條件 ， 各種制品都必須經(jīng)過安全檢驗合格者方可出廠 。 1．安全檢驗的內(nèi)容 檢驗外源性污染 滅活或脫毒效果檢查 殘余毒力或毒性物質(zhì)檢查 檢查對胚胎的毒性 （ 1） 檢驗外源性污染 不僅是因為有致病性細菌的污染 ， 而且即使是非病原菌 ，如數(shù)量過多 ， 其代謝產(chǎn)物也會影響安全 。 另外 ， 外源性的病毒及支原體的污染亦是影響安全的重要方面 。 活疫苗在采用細胞培養(yǎng)時 ， 可通過培養(yǎng)病毒的組織細胞帶來外來的病毒 ， 如：豬瘟兔化弱毒疫苗采用豬腎細胞培養(yǎng)時 ，有可能帶入野外豬瘟強毒；細胞培養(yǎng)多用犢牛血清 ， 血清就可能帶入牛病毒性腹瀉病毒 。 使用雞胚則可能帶入雞白血病等 ， 而且除原材料以外 ， 生產(chǎn)環(huán)境不佳及操作不嚴密 ， 亦可能造成外源性污染 。 1．安全檢驗的內(nèi)容 （ 2） 滅活或脫毒效果檢查 滅活疫苗都是以致病微生物加入甲醛或其它滅活劑滅活 ，而類毒素則是加入甲醛將毒素脫毒 。 但如滅活不徹底或脫毒不完全 ， 都影響制品安全性 。 1．安全檢驗的內(nèi)容 （ 3） 殘余毒力或毒性物質(zhì)檢查 殘余毒力是指生產(chǎn)疫苗類制品的菌 (毒 )種 ， 本身是活的減毒株或弱毒株 ， 允許有輕微毒力的存在 ， 能在接種的機體內(nèi)表現(xiàn)出來 。 這種殘余毒力的大小 ， 按制品不同而有不同的指標要求 ， 測定和制定方法也不一致 。 如無毒炭疽芽孢苗菌種的毒力標準是在注射部位引起劇烈水腫 ， 家兔不死亡 ，豚鼠可死亡 1/2， 小鼠可全部死亡 。 又如羊痘雞胚化弱毒疫苗的標準是試驗羊2/3可發(fā)生不全經(jīng)過型痘種 ， 持續(xù) 10天左右 ， 可有部分體溫反應(yīng) 。 毒性檢查主要是對死菌苗或類毒素這類制品 ， 這類制品雖經(jīng)殺菌或脫毒 ， 但其本身的某些成分 ， 當接種時可引起有害反應(yīng) ，即毒性反應(yīng) 。 如滅活疫苗某些污染革蘭氏陰性菌；仔豬副傷寒活疫苗凍于后的存活率過低會出現(xiàn)內(nèi)毒素反應(yīng) 。 1．安全檢驗的內(nèi)容 （ 4） 檢查對胚胎的毒性 有的病毒致弱毒株雖對免疫動物已經(jīng)致弱 ， 但還能通過孕畜影響胚胎 。 如國外豬瘟的某些弱毒株 ， 就可通過孕豬的胎盤屏障傳給胚胎以致造成死胎 、 胎兒畸形或生后發(fā)育不良等 。 因此歐洲藥典中明確規(guī)定豬瘟病毒應(yīng)經(jīng)過對胚胎毒性的檢查 。 檢查方法是：選 10頭未免疫的母豬在懷孕 25~35天時肌肉注射兩頭劑的疫苗 ， 同時另選 10頭未免疫的同齡同源懷孕母豬注射等量生理鹽水 ， 然后觀察疫苗對胎兒或仔豬是否有影響 。 1．安全檢驗的內(nèi)容 疫苗和免疫血清的成品安全檢驗方法主要是動物檢驗 ， 劑量應(yīng)大于使用劑量 。 能以小動物作出正確判斷者 ， 多用實驗小動物 。 禽用疫苗苗則可直接以使用對象動物作安檢 。 無論使用何種動物 ， 其首要條件是選用敏感的動物 。 安全檢驗用動物一般有品種要求 ， 譬如：豬丹毒以鴿和小鼠比較敏感；而豬肺疫則以家兔比較敏感 。 2．安全檢驗的方法及要點 一般概念敏感動物是不含母源抗體的 ， 如以豬檢查豬瘟疫苗的安全性 ， 就必須檢查供試豬是否含有母源豬瘟抗體 ， 無母源抗體者方可使用 。 除了動物的敏感性外 ， 動物的健康狀況也與安檢結(jié)果的正確判斷密切相關(guān) 。 2．安全檢驗的方法及要點（續(xù)） 同一種動物不同品系其敏感性也下一樣 ， 如雞新城疫的安檢雞 ， 用我國土種雞就不如用來航雞敏感 。 又如不同日齡的小鼠對豬丹毒的敏感性也下一致 ， 日齡過大敏感性差 。 試驗期間的飼養(yǎng)管理也會影響安檢結(jié)果的判斷 ， 安檢動物舍應(yīng)與健康動物和其它試驗動物分開 。 在安檢期間 ， 如安檢動物有死亡時 ， 必須及時解剖明確原因 ， 在整個安檢期內(nèi)應(yīng)及時觀察動物健康情況 ， 并予以記錄 。 3．安全檢驗的判斷 ? 安檢期死亡動物經(jīng)解剖明確非制品所致者可以重檢 ， 如檢驗結(jié)果可疑難以判定時 ， 應(yīng)以加倍頭數(shù)該種動物重檢 。 ? 凡規(guī)定用多種動物進行安檢的制品 ， 如牛瘟兔化綿羊化活疫苗用小鼠和豚鼠兩種動物檢驗 ， 兩種均應(yīng)安全合格 。 ? 用小動物檢驗不合格者 ， 有的規(guī)定可用使用對象動物重檢 。但用使用對象動物檢驗不合格者 ， 不能再以小動物重檢 。 （ 1） 用于雞的活疫苗檢驗 4．外源病毒檢驗 取樣品 2～ 3瓶混合 (如是細胞苗 ， 須用超聲波或 3次凍融方法破壞細胞 )， 用相應(yīng)含專一特異性抗體的血清中和后作為檢品 。 用雞作檢驗用動物 ， 被檢樣品不做處理 。 如對檢驗樣品中病毒中和不完全 ， 可用高效價血清重做 ， 或用制品使用對象進行檢驗 。 方法 1： 用 9~11日齡 SPF雞胚 20個 ， 分為 2組 ， 每胚各以 10個使用劑量接種 ， 第一組 10個胚接種于尿囊腔內(nèi)；第二組 10個胚接種于絨毛尿囊膜上 ， 在 37?C 培養(yǎng) ， 棄去在接種后 24小時內(nèi)死亡的胚 ， 但每組胚須存活 6個以上 。 7天后剖檢 ， 胎兒應(yīng)發(fā)育正常 ， 絨毛尿囊膜無病變 。 取雞胚液應(yīng)無血凝價 。 （ 1） 用于雞的活疫苗檢驗 —— 雞胚檢查法 方法 2： 用來自對腦脊髓炎易感雞群的 1~7日齡雞胚 15只 ， 每胚卵黃囊內(nèi)接種 ， 繼續(xù)孵化直至孵出雛雞 。 對雛雞觀察 15天 ， 不應(yīng)出現(xiàn)運動失調(diào) ， 或呈現(xiàn) AE組織病理變化的死亡 ，并至少有 9只胚孵出小雞 。 用雞胚檢查無結(jié)果或可疑時 ， 可用雞檢 1次 。 采用用補體結(jié)合 (COFAL)試驗 ， 即用 9～ 11日齡的 SPF雞胚 ，制成雞胚成纖維細胞單層 ， 將用特異性血清中和過的疫苗 (至少含 50個使用劑量 )接種于成纖維細胞單層上 ， 維持培養(yǎng)不少于 14天 ， 在此期間每隔 3~4天細胞繼代 1次 。 培養(yǎng)結(jié)束時 ，做 COFAL試驗檢查細胞中應(yīng)無雞白血病病毒 。 （ 1） 用于雞的活疫苗檢驗 —— 檢查禽白血病病毒 用適于接種本疫苗日齡的 SPF雞 20只 ， 點眼 、 滴鼻接種 10個使用劑量 ， 肌肉注射 100個使用劑量 ， 接種后 21天 ， 按上述方法重復(fù)接種 1次 ， 第一次接種后 42天采血 ， 進行有關(guān)疫病的血清抗體檢驗 。 在 42天內(nèi) ， 不應(yīng)有疫苗引起的局部或全身癥狀和呼吸道癥狀或死亡 。 如有死亡 ， 應(yīng)做病理學(xué)檢驗 ， 查明是否由于疫苗所致 。 血清抗體檢驗 ， 除本疫苗所產(chǎn)生的特異性抗體外 ， 不應(yīng)有其它疫苗的抗體存在 。 （ 1） 用于雞的活疫苗檢驗 —— 用雞檢查方法 細胞制品檢驗 ， 將 3瓶樣品混合 ， 經(jīng) 3次凍融后 ， 接種細胞單層培養(yǎng) 4天 ， 傳第二代 ， 取培養(yǎng)物 ， 分別進行丙酮固定后 ， 以適宜的熒光抗體進行染