申請基金申請技巧-第四軍醫(yī)大學科研部(編輯修改稿)
2024-10-27 15:01 本頁面
【文章內容簡介】 章題目、作者姓名、具體出處 （包括期刊名、年份、卷期、頁碼等）。 C、文獻年代要新 ：主要是近五年的文獻，最好能有 07年的最新文獻。 三、研究方案 研究目標 撰寫要求： 有限目標 ， 與研究內容相呼應 如：明確 …… 關系，揭示 …… 規(guī)律， 闡明 …… 原理（機制），建立 …… 方法等 舉例 ：篩選出與老年性白內障相關的基因，明確部分基因在白內障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內障的發(fā)生機理，為防治白內障提供線索。 研究內容： 存在問題： 內容過多，一個研究周期難以完成 內容分散，不能集中闡明研究目標 撰寫要求： 內容要適當 — 確保研究周期內完成 為目標服務 — 與目標相輔相成 要重點闡述 — 注意與技術路線區(qū)別 舉例 ： （ 1）篩選白內障相關基因： 采用改良的消減雜交技術，獲得人老年性白內障晶狀體上皮細胞和正常晶狀體上皮細胞差異表達的基因片段，建立 cDNA文庫。制備差異表達基因的基因芯片，利用基因芯片技術從多個標本的老年性白內障晶狀體上皮細胞中篩選出白內障相關基因。 （ 2）研究白內障相關基因的結構 ： …… （ 3）研究白內障相關基因在晶狀體上皮細胞變化中的作用 ： …… 觀察指標如下： ①存活細胞數(shù) ； ②光鏡、透射電鏡下細胞形態(tài)的變化 ；③細胞凋亡檢測 ：用原位末端標記和連接酶介導 PCR方法，從形態(tài)和 DNA水平分析細胞凋亡； ④細胞增殖的檢測 ： …… ； ⑤細胞骨架蛋白的檢測 ： …… ； ⑥晶狀體蛋白的檢測 ： 擬解決的關鍵問題： 存在問題： 抓不住關鍵問題或抓得不準。 什么是關鍵問題 ？ 研究過程中對達預期目標有重要影響的某些研究 內容或因素。 為達預期目標所必須掌握的關鍵技術或研究手段。 撰寫要求： 找出關鍵問題，提出解決辦法。 舉例 ： （ 1）建立差異表達的 cDNA文庫 ： 建立差異 cDNA文庫是篩選老年性白內障相關基因的前提。為使差異 cDNA文庫具有代表性，我們采取以下解決方案： ①選擇各種類型老年性白內障晶狀體的前囊膜、取足夠大量的標本（擬取 50例標本）作為建庫的 mRNA的來源。 ②利用改良的消減雜交技術可快速、有效地獲得差異表達的完整 cDNA片段。此技術是本課題組成員主要的研究成果，在應用此項技術中已積累了較豐富的實驗經(jīng)驗。 （ 2）制備基因芯片： 制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內障相關基因的關鍵環(huán)節(jié)。制備基因芯片的關鍵是在 1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探針而不使它們發(fā)生任何混淆。在制作基因芯片時做到：①嚴格按操作程序進行；②在標本的處理及 RNA提取時避免污染，否則即會造成嚴重的損失。只要嚴格按操作程序進行操作就可以避免發(fā)生差錯。 （ 3）在體基因轉染： 在體基因轉染是進行白內障相關基因功能研究的關鍵。在體的晶狀體上皮細胞大部分處在靜息狀態(tài)，只有位于赤道前區(qū)的少量細胞具有分裂活性，而且晶狀體表面有一層膠原性質的囊膜包裹。 在體晶狀體的基因轉染的關鍵是如何使大量分裂后細胞轉染，如何使病毒穿過晶狀體的囊膜，針對以上問題我們擬采取下列方法解決：①選用反轉錄病毒的慢病毒載體（ lentiviral vector ），它克服了一般反轉錄病毒只能轉染有分裂能力細胞的局限性，對分裂后細胞也能有效的轉染。這對在體晶狀體的基因轉染有很大的優(yōu)越性。②采用直徑 12μm玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體的前囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜下的上皮細胞。 研究方法 存在問題： 過于簡單：在方案中只有方法名稱而無具體步驟。 過于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實驗方法。 撰寫要求： 以研究項目的需求為前提，盡量采用最適合的方法和手段，并將其操作步驟和關鍵環(huán)節(jié)體現(xiàn)在技術路線當中。 技術路線 存在問題： 不清楚，不詳細，不可行。 撰寫要求： 清晰、詳細、注意邏輯性。 撰寫方法： — 以時間順序為主線設計技術路線 — 以研究內容為主線設計技術路線 — 分大小標題，突出邏輯關系。 — 詳細地寫清楚每個具體步驟。 （ 1）人晶狀體上皮細胞的獲得： 老年性白內障晶狀體上皮細胞取自白內障患者手術中取出的前囊膜（晶狀體上皮細胞緊貼于前囊膜），直徑約 5mm。正常晶狀體上皮細胞取自角膜移植供體眼的晶狀體，在顯微鏡下撕下前囊膜，直徑約 8mm。按文獻提供的方法去除晶狀體纖維細胞，仔細清洗以去除血細胞污染。 （ 2）建立差異 cDNA文庫： 從 50例白內障手術患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細胞作為實驗組，從 25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細胞作為對照組，利用改良的消減雜交技術 [19， 20]，獲得差異表達的 cDNA，并建立文庫。 主要的實驗流程如下： 正常晶狀體上皮細胞 白內障晶狀體上皮細胞 Promega PolyATtract174。 System 1000 mRNA分離 mRNA分離 oligodT18反轉錄 ntech Capfinder方法反轉錄 cDNA Biotin21dUTP pendingcDNA 隨機引物 PCR 雜交
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