dna甲基化及其檢測(cè)(編輯修改稿)
2025-09-07 14:48 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 左圖 DNA無(wú)甲基化 , DNA被切斷 , 無(wú)法得到 PCR產(chǎn)物 。 右圖 DNA有甲基化 , DNA保持完整 ,可以獲得 PCR產(chǎn)物 . 基因診斷中心鄭芳實(shí)驗(yàn)室 采用甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶技術(shù)結(jié)合 PCR的方法（ MSREPCR）篩選在肝癌與癌旁組織中有甲基化差異的基因 。 基因診斷中心鄭芳實(shí)驗(yàn)室 圖 13： DNM基因瓊脂糖凝膠電泳圖 M 21AE 17B 17BE 17A 17AE 21A 空 21B 21BE 100bp 250bp 150bp 400bp 500bp 注： M： Marker； E：加酶體系； A：癌組織； B：癌旁組織；空：水空白 基因診斷中心鄭芳實(shí)驗(yàn)室 優(yōu)點(diǎn) ： ①方法相對(duì)簡(jiǎn)單； ②可進(jìn)行甲基化水平的定量研究； ③需要樣本量少。 缺點(diǎn) ： ①只能獲得特殊酶切位點(diǎn)甲基化情況。 優(yōu)點(diǎn) ： 可同時(shí)檢測(cè) 基因組內(nèi)多個(gè) CpG位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果易解釋 ，成本低廉。 缺點(diǎn) ： ①由于 CG僅限于內(nèi)切酶識(shí)別序列中，因此非識(shí)別序列的 CG將被忽略； ②只有檢測(cè)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí)，該檢測(cè)方法的結(jié)果才有意； ③需要樣本量大； ④存在酶消化不完全引起的假陽(yáng)性的問(wèn)題； ⑤不適用于混合樣本。 應(yīng)用五：甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析（ methylation specific singlestrand conformation analysis， MSSSCA） 甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析 優(yōu)點(diǎn) ： ①能夠方便的應(yīng)用于任何序列的甲基化狀態(tài)分析； ②能夠?qū)谆牡任换蜻M(jìn)行半定量； ③可以提示甲基化狀態(tài)分布的不均勻性。 缺點(diǎn) ： ①只有甲基化水平較高的單鏈才能明顯的區(qū)分開(kāi)，而較低水平的則不易分開(kāi)，有時(shí)會(huì)因甲基化的 CpG位點(diǎn)隨機(jī)和不均勻分布導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)擁擠、拖尾的現(xiàn)象，故敏感性及準(zhǔn)確性略低； ②檢測(cè)片段不宜過(guò)長(zhǎng)。 啟動(dòng)子區(qū)甲基化芯片技術(shù) HRM技術(shù)： 用于篩選大量樣本，獲得感興趣的 CpG位點(diǎn) 鑒定感興趣的 CpG 島 。 HRM技術(shù)原理 HRM技術(shù)原理 HRM特點(diǎn) ? 高靈敏性：可檢測(cè)低達(dá) %甲基化程度。 ? 高通量： 1次可同時(shí)檢測(cè)不超過(guò) 384樣本，適用于大樣本多位點(diǎn)甲基化掃描。 ? 高重復(fù)性：重復(fù)性 100%。 ? 使用范圍廣：不受堿基位點(diǎn)局限。 ? 操作簡(jiǎn)便：只需設(shè)計(jì)特異引物，無(wú)須序列特異性探針，無(wú)需測(cè)序。 標(biāo)本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測(cè)。 應(yīng)用十：焦磷酸測(cè)序法 ?是由 4種酶 DNA聚合酶、 ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) ?每一輪測(cè)序反應(yīng)體系中只加入一種 dNTP。如果該 dNTP與模板配對(duì)，則會(huì)在 DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的 3’末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸
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