【文章內(nèi)容簡介】 μL預冷無水乙醇，輕柔混勻后于 30 176。C℃放置 30 min；4 176。C ℃12 000 r/min 離心 15 min，小心棄去上清液。加入 500 μL 預冷 75% 乙醇洗滌，4 176。C℃ 12 000 r/min 離心 15 min，小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥 20 min。每管加入 20 μL 超純水，充分溶解后于 30 176。C ℃保存?zhèn)溆谩?RAPD擴增與檢測根據(jù)本實驗室以往的經(jīng)驗和電泳譜帶的多態(tài)性程度，選取適宜的隨機引物 6 條：HF1H16 (De Barro and Driver, 1997)、C08 (Callejas et al., 2005)、OPD0OPD03 (Patra et al., 2008)。然后分別采用上述6 條隨機引物(上海生工生物工程技術有限公司協(xié)助合成)，以西花薊馬以及其他 9 種(即花薊馬 F. intonsa、禾花薊馬 F. tenuicornis、煙薊馬 T. tabaci、蔥韭薊馬 T. alliorum、黃胸薊馬 T. hawaiiensis、八節(jié)黃薊馬 T. flavidulus、豆大薊馬 Megalurothrips usitatus、茶黃硬薊馬 Scirtothrips dorsalis 和稻簡管薊馬 Haplothrips aculeatus)田間常見薊馬種類的DNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為 20 μL， μL、10 buffer μL、dNTP (10 mmol/L) μL、Taq 聚合酶 (5 U/μL) μL、隨機引物 (20 ng/μL) μL、模板DNA μL。擴增程序為：94 176。C℃預變性 5 min；45個循環(huán)：94 176。C℃ 1 min、36 176。C℃ 1 min、72 176。C ℃ 6 min；最后 72 176。C℃ 延伸 6 min。擴增反應在 ABI9700 PCR基因擴增儀上運行。取 6 μL % (重量)瓊脂糖(Amresco)凝膠上以 80 V 電泳分離50 min，然后以 GelDoc Universal Hood II 型凝膠成像系統(tǒng)(BioRad Laboratories)分析電泳結(jié)果。 特征序列擴增區(qū)域(SCAR)標記分析將RAPDPCR擴增產(chǎn)物中西花薊馬特有的片段進行切膠回收DNA (Omega)，連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測序，根據(jù)測序結(jié)果設計西花薊馬特征片段擴增引物1對；然后，根據(jù)所擴增的目的片段檢驗 SCAR 引物的特異性。PCR反應體系為 20 μL，其中超純水 μL、10 buffer μL、dNTP (10 mmol/L) μL、Taq聚合酶 (5 U/μL) μL、上游引物和下游引物 (20 ng/μL) μL、模板DNA μL。擴增程序為：94 176。C℃ 預變性 2 min；35個循環(huán)：94176。C℃ 25 s、56 176。C℃ 25 s、72 176。C℃ 45 s；最后 72 176。C℃ 延伸 5 min。 西花薊馬 SCAR引物的種特異性及靈敏性檢驗分別以田間采集的分屬3科21屬的41種薊馬(表1)的DNA為模板，以西花薊馬為陽性對照，檢驗西花薊馬SCAR引物 FOMF/FOMR 的種特異性。同時，以不同性別及蟲態(tài)(雌性成蟲和雄性成蟲；單粒卵，單頭一1齡幼蟲、二2齡幼蟲、預蛹、蛹)的西花薊馬DNA以及梯度稀釋(1/1/1/1/80、1/160、1/31/61/1 280、1/2 560、1/5 120頭成蟲）的單頭雌性成蟲DNA為模板，進行靈敏性檢驗，每蟲態(tài)、每梯度分別測定10頭。 西花薊馬發(fā)生地的寄主植物檢測西花薊馬發(fā)生地的寄主植物采集于北京世界花卉大觀園，種類有滿天星、石竹、四季海棠、蜘蛛蘭、冬瓜、黃瓜等。其中冬瓜的檢測部位為葉片，其余均為處于開花盛期的鮮花花瓣。 g，以40 μL提取緩沖液進行勻漿，；。2 結(jié)果與分析 PCR隨機擴增及SCAR標記分析以西花薊馬以及田間常見的其他9種薊馬的DNA為模板，以6條隨機引物分別進行擴圖1 隨機引物OPD08對西花薊馬及9種田間常見薊馬擴增結(jié)果電泳檢測圖 RAPD profiles of Frankliniella occidentalis and other nine familiar thrips species using random primer OPD08M: DNA分子量標準DNA ladder marker。 1: 西花薊馬F. occidentalis(Pergande)。 2: 花薊馬F. intonsa (Trybom)。 3: 禾花薊馬F. tenuicornis (Uzel)。 4: 煙薊馬Thrips tabaci Lindeman。 5: 蔥韭薊馬T. alliorum (Priesner)。 6: 黃胸薊馬T. hawaiiensis (Morgan)。 7: 八節(jié)黃薊馬T. flavidulus (Bagnall)。 8: 豆大薊馬Megalurothrips usitatus (Bagnall)。 9: 茶黃硬薊馬Scirtothrips dorsalis Hood。 10: 稻簡管薊馬Haplothrips aculeatus (Fabricius). 箭頭所示為西花薊馬的特異性條帶. The arrow indicates the specific fragment of the western flower thrips.M12 3 4 5 6 7 8 9 10bp2 0001 000750500250100增。電泳檢測結(jié)果顯示，隨機引物OPD08 (GTGTGCCCCA)的特異性較強、電泳譜帶多態(tài)性高(圖1)，能擴增出一條西花薊馬特有的條帶(圖1中箭頭所示)。將該特異條帶切膠、回收純化，并對純化產(chǎn)物進行電泳檢測。然后將回收產(chǎn)物與pGEMT Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)細胞[ (天根生化科技(北京)有限公司])；通過藍白斑篩選，挑取白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進行PCR鑒定；然后將分子量大小與預期一致的陽性菌落送上海英駿生物技術有限公司進行測序。測序結(jié)果表明該片段長 569 bp，GenBank登錄號為GU045557，為基因組DNA中的隨機克隆片段。根據(jù)測序結(jié)果設計SCAR引物1對：FOMF/FOMR，上游引物堿基序列為：5′ GAAAC TACTA TTGTT TGTGA GCTG 3′，下游引物堿基序列為：5′ AAGAA ACTAA CGTGA AGGAT ACTC 3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司協(xié)助合成，其擴增片段大小為 320 bp。 西花薊馬 SCAR引物的種特異性及靈敏性檢驗以西花薊馬及田間采集的其他41種薊馬的DNA為模板，以所設計的特異性引物FOMF/FOMR進行PCR擴增，電泳檢測結(jié)果顯示(圖2)，該引物只對西花薊馬具有擴增效果，對其他種類的薊馬不具有擴增能力，表明該引物為西花薊馬的特異性引物。圖2 SCAR 引物 FOMF/FOMR種特異性檢驗Fig. 2 Amplification pattern of genomic DNA using SCAR primers FOMF/FOMRM: DNA分子量標準DNA ladder marker。 泳道1, 16, 17, 32, 33, 47: 西花薊馬Frankliniella occidentalis。 215, 1831, 3446: 其他種類薊馬，編號順序與表1同 Other thrips species, numbered in the same order as in the Table 1.2 0001 0007505002501002 0001 000750500250100M10987654321bpM111213141516bp2 0001 0007505002501002 0001 000750500250100M474645444342bpM414039383736353433bp2 0001 0007505002501002 0001 000750500250100M282930313217bpM27262524232221201918bp以不同性別和不同蟲態(tài)的西花薊馬DNA為模板，以SCAR引物FOMF/FOMR進行PCR擴增，檢測結(jié)果顯示，不同性別、不同蟲態(tài)的西花薊馬(圖3：A)均能穩(wěn)定地擴增出 320 bp 的特異性片段。當將單頭雌性成蟲的DNA模板進行梯度稀釋至1/160頭時，所有個體均可擴增出特異性的靶標片段；當稀釋為1/320頭成蟲時，80%的個體條帶清晰；當稀釋為1/1 280頭成蟲時，尚有20%的個體可以擴增出微弱的靶標片段(圖3：B)。表明，該對引物靈敏性較高，其最低檢出閾值為1/160頭成蟲。圖3 SCAR引物FOMF/FOMR對西花薊馬DNA模板靈敏性檢測電泳圖Fig. 3 Amplification pattern of Frankliniella occidentalis DNA using SCAR primers FOMF/FOMR.A: 不同蟲態(tài)和性別Different developmental stages and sexes. M: DNA分子量標準DNA ladder marker。 1: 單粒卵One egg。 2: 1齡幼蟲First 1st instar larva。 3: 2齡幼蟲Second 2nd instar larva。 4: 預蛹Prepupa。 5: 蛹Pupa。 6: 雌性成蟲Female adult。 7: 雄性成蟲Male adult. B: 不同模板稀釋倍數(shù)Different dilutions. M: DNA分子量標準DNA ladder maker。 110：分別為 1∕1∕1∕1∕80、1∕160、1∕320﹑，1∕ 61/1 280、1/2 560、和1/5 120頭雌性成蟲DNA . Lanes 110 were dDilutions 1∕10, 1∕20, 1∕40, 1∕80, 1∕160, 1∕320 1∕ 640, 1/1 280, 1/2 560 and 1