【正文】 07)；二是傳播植物病毒，如菊花莖壞死病毒(chrysanthemum stem necrosis virus, CSNV) (Bezzara et al., 1999)、花生環(huán)斑病毒(groundnut ringspot virus, GRSV) (Wijkamp et al., 1995)、鳳仙斑點(diǎn)壞死病毒(impatiens necrotic spot virus, INSV) (De Angelis et al., 1993。 周力兵等, 2007)。 Moritz et al., 2004)鑒定確認(rèn)。C℃ 12 000 r/min 離心 15 min，小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥 20 min。C℃ 1 min、36 176。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 176。 西花薊馬發(fā)生地的寄主植物檢測(cè)西花薊馬發(fā)生地的寄主植物采集于北京世界花卉大觀園，種類有滿天星、石竹、四季海棠、蜘蛛蘭、冬瓜、黃瓜等。 5: 蔥韭薊馬T. alliorum (Priesner)。然后將回收產(chǎn)物與pGEMT Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞[ (天根生化科技(北京)有限公司])；通過藍(lán)白斑篩選，挑取白斑菌落過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定；然后將分子量大小與預(yù)期一致的陽(yáng)性菌落送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。當(dāng)將單頭雌性成蟲的DNA模板進(jìn)行梯度稀釋至1/160頭時(shí)，所有個(gè)體均可擴(kuò)增出特異性的靶標(biāo)片段；當(dāng)稀釋為1/320頭成蟲時(shí)，80%的個(gè)體條帶清晰；當(dāng)稀釋為1/1 280頭成蟲時(shí)，尚有20%的個(gè)體可以擴(kuò)增出微弱的靶標(biāo)片段(圖3：B)。 6: 雌性成蟲Female adult。 5: 蜘蛛蘭花瓣Flowers of spider orchid,。本研究采用的SCAR分子標(biāo)記技術(shù)特異性強(qiáng)，可以將西花薊馬與我國(guó)常見的41種其他種類的薊馬區(qū)分開。游中華等(2007)采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)包括西花薊馬在內(nèi)的9種薊馬的COI基因片段(433 bp)進(jìn)行序列分析，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)各蟲態(tài)的西花薊馬；但是，由于需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，成本較高且費(fèi)時(shí)，因此難以滿足高通量快速檢測(cè)的需求。此外，SCAR檢測(cè)技術(shù)操作方便快捷，結(jié)果可靠且穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高，可以快速檢測(cè)大量個(gè)體。而更為有價(jià)值的是，該技術(shù)還可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)西花薊馬發(fā)生地的寄主植物是否帶有卵，表明，該SCAR標(biāo)記技術(shù)完全可以用于口岸及蔬菜、花卉、種苗調(diào)運(yùn)中西花薊馬的檢測(cè)及其擴(kuò)散趨勢(shì)監(jiān)測(cè)。 泳道7: 西花薊馬未發(fā)生區(qū)的黃瓜花瓣Cucumber flowers collected from F. occidentalis uninfested fields as the negative control.擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果表明，在冬瓜的葉片以及滿天星、石竹、四季海棠、蜘蛛蘭和黃瓜的花瓣中均擴(kuò)增出了靶標(biāo)片段，且條帶清晰(圖4)，表明該技術(shù)體系對(duì)帶有蟲卵的寄主植物組織亦具有同樣的檢測(cè)效果。 110：分別為 1∕，1∕，1∕，1∕80、1∕160、1∕320﹑，1∕ 6，1/1 280、1/2 560、和1/5 120頭雌性成蟲DNA . Lanes 110 were dDilutions 1∕10, 1∕20, 1∕40, 1∕80, 1∕160, 1∕320 1∕ 640, 1/1 280, 1/2 560 and 1/5 120 DNA of a whole female adult of F. occidentalis, respectively.M12345672 0001 000750500250100AM123456789102 0001 000750500250100B 西花薊馬發(fā)生地寄主植物組織的檢測(cè)以西花薊馬發(fā)生地的寄主植物組織DNA為模板，以SCAR引物FOMF/FOMR進(jìn)行PCR M1234567bp2 0001 000750500250100圖4 SCAR引物FOMF/FOMR對(duì)西花薊馬發(fā)生地寄主植物組織檢測(cè)電泳圖Fig. 4 Amplification pattern of host plant tissues collected from Frankliniella occidentalis infested fields using SCAR primers FOMF/FOMR.M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder marker。圖3 SCAR引物FOMF/FOMR對(duì)西花薊馬DNA模板靈敏性檢測(cè)電泳圖Fig. 3 Amplification pattern of Frankliniella occidentalis DNA using SCAR primers FOMF/FOMR.A: 不同蟲態(tài)和性別Different developmental stages and sexes. M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder marker。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)SCAR引物1對(duì)：FOMF/FOMR，上游引物堿基序列為：5′ GAAAC TACTA TTGTT TGTGA GCTG 3′，下游引物堿基序列為：5′ AAGAA ACTAA CGTGA AGGAT ACTC 3′。 7: 八節(jié)黃薊馬T. flavidulus (Bagnall)。 g，以40 μL提取緩沖液進(jìn)行勻漿，；。C℃ 25 s、56 176。C ℃ 6 min；最后 72 176。C ℃保存?zhèn)溆?。將單頭西花薊馬/其他種類薊馬置于滴有 20 μL提取緩沖液 (50 mmol/L TrisHCl, l mmol/L EDTA, 1% SDS, 20 mmol/L NaCl, pH )的parafilm膜上, 以PCR管底部作為勻漿器充分研磨， mL離心管；然后以200 μL緩沖液分2次沖洗勻漿器、合并混勻；加入 5 μL蛋白酶 K (20 mg/mL)，充分混勻后于 60 176。與通常采用的限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、堿基序列測(cè)定等方法相比，SCAR標(biāo)記技術(shù)免去了篩選限制性內(nèi)切酶和堿基序列測(cè)定的過程，不僅結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高、重復(fù)性能好，而且操作簡(jiǎn)便、成本低，特異性引物一旦獲得，即可用于大規(guī)模檢測(cè)分析。西花薊馬體型微小，~ mm，并且與其他薊馬種類形態(tài)十分相似。我國(guó)于2000年首次在昆明國(guó)際花卉節(jié)參展的緬甸盆景上截獲西花薊馬(蔣小龍等, 2001)，2003年在北京溫室的辣椒上發(fā)現(xiàn)其為害(張友軍等, 2003)，隨后在云南(徐家菊和韋麗莉, 2005)、山東(鄭長(zhǎng)英等, 2007)等地亦發(fā)現(xiàn)其為害。關(guān)鍵詞：西花薊馬；RAPDPCR；SCAR；快速檢測(cè)；特異擴(kuò)增；檢出閾值中圖分類號(hào): Q966 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 04546296(2010)03000000SCAR marker for rapid identification of the western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae)MENG XiangQin1, MIN Liang1,3, WAN FangHao1,2, ZHOU ZhongShi1,2, WANG WenKai3, ZHANG GuiFen1,2,* (1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China。針對(duì)薊馬類害蟲蟲體微小、形態(tài)相似，難以準(zhǔn)確快速區(qū)分的問題，采用特征序列擴(kuò)增區(qū)域（SCAR）標(biāo)記技術(shù)，以西花薊馬及與之同域發(fā)生的其他種類薊馬為對(duì)象，篩選出1對(duì)西花薊馬特異性引物（FOMF/FOMR），其擴(kuò)增片段大小為320 bp。 RAPDPCR。西花薊馬的寄主范圍十分廣泛，包括菊科、葫蘆科、茄科、豆科、十字花科等在內(nèi)的62科，500多種植物，基本涉及所有的開花植物(Yudin et al., 1986。 Brunner et al., 2002。1 材料與方法 供試蟲源西花薊馬種群以市售扁豆飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所南區(qū)養(yǎng)蟲室，國(guó)內(nèi)發(fā)生的其他種類的薊馬均采自田間，具體采集信息如表1所示。C℃放置 30 min；4 176。反應(yīng)體系為 20 μL， μL、10 buffer μL、dNTP (10 mmol/L) μL、Taq 聚合酶 (5 U/μL) μL、隨機(jī)引物 (20 ng/μL) μL、模板DNA μL。取 6 μL % (重量)瓊脂糖(Amresco)凝膠上以 80 V 電泳分離50 min，然后以 GelDoc Universal Hood II 型凝膠成像系統(tǒng)(BioRad Laboratories)分析電泳結(jié)果。C℃ 延伸 5 min。 2: 花薊馬F. intonsa (Trybom)。 10: 稻簡(jiǎn)管薊馬Haplothrips aculeatus (Fabricius). 箭頭所示為西花薊馬的特異性條帶. The arrow indicates the specific fragment of the western flower thrips.M12 3 4 5 6 7 8 9 10bp2 0001 000750500250100增。圖2 SCAR 引物 FOMF/FOMR種特異性檢驗(yàn)Fig. 2 Amplification pattern of genomic DNA using SCAR primers FOMF/FOMRM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder marker。 3: 2齡幼蟲Second 2nd instar larva。s breath,。鑒于目前西花薊馬僅在我國(guó)局部地區(qū)發(fā)生危害(張友軍等, 2003。Brunner等(2002)根據(jù)線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基ⅠI (mitochondria cytochrome oxidase subunit I, mtDNA COI) 433 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)合測(cè)序和擴(kuò)增產(chǎn)物RFLP分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，有效區(qū)分了西花薊馬、煙薊馬和棕櫚薊馬