【文章內容簡介】 試管，編號，取出一支試管作為空白對照，然后分別向其余的5支試管中準確的加入0 mL， mL， mL， mL， mL， mL濃度為l mg/mL標準蛋白質溶液， mL，其添加方法及順序如表26所示。最后再分別向各試管中加入5 mL的考馬斯亮藍G250溶液，每加完一管，立刻混合搖勻。(2)經充分混合后在室溫下放置2~5 min后就可以開始用石英比色皿在分光光度計上測定各樣品在595 mn處的光吸收值A595nm，空白對照樣品為1號試管， mL水，5 mL考馬斯亮藍G250溶液。(3)以用吸光度值A595nm為縱坐標，標準蛋白質量(mg)為橫坐標，繪制標準曲線圖，可得到一條標準曲線。表26 考馬斯亮藍法實驗表試管號試劑123456標準蛋白溶液/mL0蒸餾水/mL2）樣品中的蛋白含量測定取9只試管并編號，1~，按照1）中的測定方法，使未知樣品測定值在標準曲線的測定范圍內。根據(jù)所測定的A595nm值，在(3)中制得的標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，再乘以稀釋倍數(shù)計算出原樣品中的蛋白濃度(mg/mL)。 儀器：高效液相色譜儀（如圖21所示）、一次性注射器、針式濾膜、精密PH試紙。藥品：乙腈（色譜純）、磷酸二氫鉀、超純水（或用娃哈哈純凈水代替）。注：在本方法中所用的水均為超純水。試劑的準備1）尿素標準溶液：準確稱取2 g尿素標準品于100 mg/mL的尿素標準儲備液，再分別稀釋為濃度為1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL的標準溶液，用 181。m的針式濾膜過濾，濾液待用。2）三聚氰胺標準溶液：準確稱取100 mg三聚氰胺標準品于100 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液。再將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的濃度為5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL 的標準工作液。 181。m的針式濾膜過濾，濾液待用。3）磷酸鹽緩沖液： mol/L。 g磷酸二氫鉀（ g），加800 mL水使其完全溶解后，再用磷酸調節(jié)為pH=，用水稀釋至1L， 181。m的針式濾膜過濾后備用。樣品前處理稱取5 mL牛奶樣品，置于50 mL具塞刻度試管中，加入30 mL乙腈，劇烈振蕩6 min后加水定容至滿刻度，充分混勻，靜置3 min，用一次性注射器吸取上清液用針式過濾器( μm)過濾后，作為高效液相色譜分析用試樣。圖22 高效液相色譜儀尿素及三聚氰胺標準曲線的繪制1）尿素標準曲線的繪制：按以下色譜條件對尿素標準溶液進行高效液相色譜檢測。色譜條件： 色譜柱：ZORBAX300SBC18色譜柱（250 mm mm，5 μm） 檢測器：紫外檢測器 流動相：乙腈：水=5：95 (體積比) 檢測波長：220 nm 流速：1 mL/min 柱溫：室溫 進樣體積：10 μL在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入尿素標準系列溶液，記錄色譜峰面積，以尿素溶液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，相應的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。2）三聚氰胺標準曲線的繪制：按以下色譜條件對三聚氰胺標準溶液進行高效液相色譜檢測。色譜條件：色譜柱：ZORBAX300SBC18色譜柱（250 mm mm，5 μm）檢測器：紫外檢測器 流動相：磷酸鹽緩沖液：乙腈=70：30 (體積比) 檢測波長：240 nm 流速：1 mL/min 柱溫：40 ℃ 進樣體積：10 μL在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入三聚氰胺標準系列溶液，記錄色譜峰面積，以三聚氰胺溶液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，相應的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。樣品的測定將2中制備好的樣品作為空白樣分別按3中1）和2）的色譜條件進行進樣分析。取已知三聚氰胺或尿素含量的牛奶樣品，對應的加入一定量的標準儲備液，按“樣品前處理” 操作，平行制備3份，得到樣品溶液后按上述色譜條件對應的進行進樣分析。第3章 實驗結果與分析 第3章 實驗結果與分析 凱氏定氮法的實驗數(shù)據(jù)處理及結果分析，所得結果如表31所示表31 凱氏定氮法試驗數(shù)據(jù)組號樣品編號V1/ mL空白樣品編號V2/ mLV1V2/ mL114225336 表中：V1 為樣品消耗標準鹽酸體積；V2為空白樣消耗標準鹽酸體積。根據(jù)公式：其中： c= mol/ LF= m=5 g代入上式可得到三組數(shù)據(jù)，如表32所示表32 凱氏定氮法的計算結果組號123實測值/ g/100mL平均值/ g/100mL第3章 實驗結果與分析 g/100mL。該方法測得的蛋白質含量為X= g/100mL， g/100mL，所以凱氏定氮法測得的氮含量是樣品中的蛋白氮與非蛋白氮的總和。因此，凱氏定氮法適合用于測定樣品的總的氮含量。 雙縮脲法的實驗數(shù)據(jù)處理及結果分析 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算，使每毫升尿素溶液和三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量的方法對樣品進行摻雜。由于蛋白質中氮元素的平均質量分數(shù)為16%，又通過計算可知，尿素（CO(NH2)2）%，三聚氰胺(C3N3(NH2)3)%。 g/100mL， g/100mL， g/100mL。，測得的數(shù)值如表33所示。表33 雙縮脲法測得的標準酪蛋白溶液在550nm處的吸光度值A550nm蛋白質含量/ mg/mL0吸光度值A550nm000圖31 雙縮脲法測得的酪蛋白標準曲線其對應蛋白質含量的吸光度的平均值分別為：0、、。根據(jù)上述數(shù)據(jù)作蛋白質含量吸光度圖，得到雙縮脲法測得的酪蛋白標準曲線，如圖31所示。圖31所示，雙縮脲法以酪蛋白為標準蛋白，由所繪制的標準曲線可知，其線性方程為Y=，相關系數(shù)為R2=，這表明酪蛋白與雙縮脲試劑的線性關系好，因此可知雙縮脲法所需的標準蛋白可以用酪蛋白。實驗數(shù)據(jù)及處理）中的方法用722型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的尿素溶液的未知樣品溶液在550nm處的吸光度值A550nm，測得的數(shù)值如表34所示。以根據(jù)表34中測得的樣品的吸光度值在圖31所示的標準曲線上查出對應的蛋白質含量(mg)，代入下式：蛋白質含量（mg/mL）=標準曲線上查得的蛋白質含量（mg/mL)50(mL) 247。樣品體積（mL）計算可得雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質的含量，如表35所示。表34 雙縮脲法測得的摻雜尿素溶液的未知樣品在550nm處的吸光度值A550nm試管編號12345吸光度值A550nm表35 雙縮脲法測定牛奶中摻入尿素溶液的蛋白質含量樣品號實測值/ g/L平均值/ g/L理論值/ g/L誤差率/ %RSD/%12345結果分析%、%、%、%,%、%、%、%。由此看來，使用雙縮脲法測定摻入尿素的牛奶樣品的方法基本準確，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性一般，因此需要通過多次重復實驗得到多組數(shù)據(jù)求平均值才可以得到比較準確的結果。 雙縮脲法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質含量的測定實驗數(shù)據(jù)及處理同理可得用722型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在550nm處的吸光度值A550nm，測得的數(shù)值如表36所示。表36 雙縮脲法測得的添加三聚氰胺溶液的樣品在550nm處的吸光度值A550nm試管編號16789吸光度值A550nm表37 雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質含量樣品號實測值/ g/L平均值/ g/L理論值/ g/L誤差率/ %RSD/%16789以根據(jù)表36中測得的樣品的吸光度值在圖31所示的標準曲線上查出對應的蛋白質含量(mg)，代入下式：蛋白質含量（mg/mL）=標準曲線上查得的蛋白質含量（mg/mL)50(mL)247。樣品體積（mL）計算可得雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質的含量，如表37所示。結果分析%、%、%、%，%、%、%、%。由此看來，使用雙縮脲法測定摻入三聚氰胺的牛奶樣品的方法比較準確，該法測得的數(shù)據(jù)的數(shù)值上的差異也不是很大，因此如通過多次重復實驗得到多組數(shù)據(jù)求平均值可以得到更加準確的結果。 考馬斯亮藍法的實驗數(shù)據(jù)處理及結果分析 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算，使每毫升尿素溶液和三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量的方法對樣品進行摻雜。由于蛋白質中氮元素的平均質量分數(shù)為16%，又通過計算可知，尿素（CO(NH2)2）%，三聚氰胺(C3N3(NH2)3)%。 g/100mL， g/100mL， g/100mL。，測得的數(shù)值如表38所示。表38 考馬斯亮藍法測得的標準酪蛋白溶液在595nm處的吸光度值A595nm蛋白質含量/ 100μg/mL0吸光度值A595nm000其對應蛋白質含量的吸光度的平均值分別為：0、、。根據(jù)上述數(shù)據(jù)作蛋白質含量吸光度圖，得到考馬斯亮藍法測得的酪蛋白標準曲線，如圖38所示。圖32 考馬斯亮藍法測得的酪蛋白標準曲線圖32所示，考馬斯亮藍法以酪蛋白為標準蛋白，由所繪制的標準曲線可知，其線性方程為Y=－，相關系數(shù)為R2=，這表明酪蛋白與考馬斯亮藍G250試劑的線性關系好，因此可知考馬斯亮藍法所需的標準蛋白可以用酪蛋白。 考馬斯亮藍法對摻雜尿素的未知樣品溶液中的蛋白質含量的測定實驗數(shù)據(jù)及處理）中的方法用722型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的尿素溶液的未知樣品溶液在595nm處的吸光度值A595nm，測得的數(shù)值如表39所示。以根據(jù)表39中測得的樣品的吸光度值在圖32所示的標準曲線上查出對應的蛋白質含量(mg)，代入下式：蛋白質含量（mg/mL）=標準曲線上查得的蛋白質含量（μg/mL) 500(mL) 247。[樣品體積（mL）1000]計算可得考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質的含量，如表310所示。表39 考馬斯亮藍法測得的添加尿素溶液的樣品在595nm處的吸光度值A595nm試管編號12345吸光度值A595nm結果分析%、%、%、%,%、%、%、%。由此看來，使用考馬斯亮藍法測定摻入尿素的牛奶樣品的方法與理論差值的誤差比較大，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此該方法可以不通過進行多次重復實驗就可以得到結果。表310 考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質含量樣品號實測值/ g/L平均值/ g/L理論值/ g/L誤差率/ %RSD/%12345 考馬斯亮藍法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質含量的測定實驗數(shù)據(jù)及處理同理可得用722型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在595nm處的吸光度值A595nm，測得的數(shù)值如表311所示。以根據(jù)表311中測得的樣品的吸光度值在圖32所示的標準曲線上查出對應的蛋白質含量(mg)，代入下式：蛋白質含量（mg/mL）=標準曲線上查得的蛋白質含量（μg/mL)500(mL) 247。 [樣品體積（mL）1000]表311 考馬斯亮藍法測得的添加三聚氰胺的未知樣品在595nm處的吸光度值A595nm試管編號16789吸光度值A595nm計算可得考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質的含量，如表312所示。表312 考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質含量樣品號實測值/ g/L平均值/ g/L理論值/ g/L誤差率/ %RSD/%16789結果分析%、%、%、%，%、%、%、%。由此看來，使用考馬斯亮藍法測定摻入三聚氰胺的牛奶樣品的方法與理論差值的誤差比較大，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此該方法可以不通過進行多次重復實驗就可以得到結果。，考馬斯亮藍法的準確性不如雙縮脲法得出的結果準確，但是在理論