5、轉(zhuǎn)錄調(diào)控(編輯修改稿)
2024-08-21 14:30 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，挑取單克隆，用基因B啟動子內(nèi)部引物鑒定，挑取鑒定正確的克隆 5 送測序。用 Vector NTI （Invitrogen）軟件對測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對。留取測序正確的菌株凍入80℃保存。用構(gòu)建好的 pGL3Basic基因BP (1761/+37)為模板擴(kuò)增不同長度的片段，按上述的步驟連入pGL3Basic質(zhì)粒，測序鑒定正確，80℃保存。我們將成功構(gòu)建的基因B啟動子區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并同時(shí)轉(zhuǎn)入pRLTK載體作為內(nèi)對照。48 小時(shí)后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析。如圖所示： 1761271016433217 六個(gè)不同長度的片段都能夠啟動基因B的轉(zhuǎn)錄，而217 片段基本喪失轉(zhuǎn)錄活性，提示基因B的轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域就位于這段序列中。運(yùn)用TRANSFAC轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測網(wǎng)站我們發(fā)現(xiàn)在這250bp區(qū)域內(nèi)含有4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子A 的結(jié)合位點(diǎn)。那么具體是哪個(gè)位點(diǎn)對基因B的轉(zhuǎn)錄起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，然后我們又將這250bp的序列截成三部分，檢測其熒光報(bào)告強(qiáng)度。結(jié)果顯示當(dāng)將108到42這段序列截掉后，基因B的轉(zhuǎn)錄活性基本喪失，這說明基因B的轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域就位于在基因B啟動子108到42 內(nèi)。這段區(qū)域決定了基因B約 70%的轉(zhuǎn)錄活性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，轉(zhuǎn)錄因子A可能通過108到42kb這60bp 之間序列激活基因B的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性。注釋：如上是尋找轉(zhuǎn)錄因子與基因結(jié)合位點(diǎn)的套路方案，通過截短不同區(qū)域?qū)ふ业交钚躁P(guān)鍵區(qū)域。 對基因B的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用將編碼轉(zhuǎn)錄因子A的基因序列連入真核表達(dá)載體 (+)后經(jīng)酶切鑒定，出現(xiàn)了＿bp 目的條帶，結(jié)果與前期設(shè)計(jì)相符，證明在真核表達(dá)載體中插入了相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子A蛋白編碼序列，命名為 。 上調(diào)基因B的轉(zhuǎn)錄表達(dá) 結(jié)合基因B啟動子為了證明轉(zhuǎn)錄因子A
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