【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 物二聚體，以區(qū)分非特異擴(kuò)增；利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及 SNP 檢測(cè)等。 目前實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。原理：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ( PCR) 可對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增 。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，可以通過(guò)凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過(guò)放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來(lái)進(jìn)行定量的分析 。無(wú)論定性還是定量分析，分析的都是 PCR 終產(chǎn)物。而實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 則是通過(guò)對(duì) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖：Fig Threshold value curve and CT value曲線閾值與Ct值熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，所以PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。CT 值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， CT 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表 CT 值。因此，只要獲得未知樣品的 CT 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。Fig Standardard curve實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行。SYBR Green I 是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈 DNA 結(jié)合染料。與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。 SYBR Green I的最大吸收波長(zhǎng)約為 497nm ，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為 520nm 。 在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過(guò)量 SYBR熒光染料， SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。 SYBR Green I在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性且價(jià)格相對(duì)較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過(guò)熔點(diǎn)曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以、區(qū)分非特異擴(kuò)增，進(jìn)一步地還可以實(shí)現(xiàn)單色多重測(cè)定。此外，由于一個(gè) PCR 產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此 SYBR Green I的靈敏度很高。由解鏈曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由 SYBR Green I得到定量結(jié)果。一般而言，探針?lè)ū热玖戏ǎㄈ鏢YBR Green I）最廣泛使用的TaqMan探針就是運(yùn)用了這個(gè)原理。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，此時(shí)5′端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3′端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET），因此探針完整時(shí)，檢測(cè)不到該探針5′端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。但在PCR擴(kuò)增中，溶液中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5′3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 引物設(shè)計(jì)和內(nèi)參基因的選擇為了去除不同標(biāo)本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異,通常選擇一定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。內(nèi)參基因擴(kuò)增中的變化可以反映RNA產(chǎn)量、質(zhì)量和/或cDNA合成效率的變化。選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因以減少檢測(cè)標(biāo)本間的差異是必須的。內(nèi)參基因應(yīng)具備的條件理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件:①不存在假基因(pseudogene),以避免基因組DNA的擴(kuò)增。②高度或中度表達(dá),排除太高或低表達(dá)。③穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織(如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞),而且其表達(dá)量是近似的,無(wú)顯著性差別。④表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無(wú)關(guān)。⑤其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似。⑥不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響,如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響。排除內(nèi)參基因的條件則為:①在正常和異常的細(xì)胞/組織中的表達(dá)存在差異。②呈現(xiàn)細(xì)胞周期依賴的表達(dá)。 ③定位于X染色體。本次研究選擇人betaactin作為內(nèi)參基因，可以滿足以上條件。采用第二章已經(jīng)建立起來(lái)到TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR平臺(tái)，設(shè)計(jì)的TaqMan探針和引物如下：引物名稱序列(5’224。3’)引物特征產(chǎn)物長(zhǎng)度bpTERCC1ATACCCCTCGACGAGGATGAG第II外顯子末端77ACAGTGGGAAGGCTCTGTGTAGA第III外顯子始端FAM CGGAATAAGGGCTTGGCCACTCCATAMRA第II與III外顯子連接處ASERCC1CCAGCGGACCTCCTGATG第VII外顯子末端151和79*CTCTTGATGCGGCGATGAG第IX外顯子始端FAMAGGACTTCGTCTCCCGGTCTCTGGAACTAMRA第VII與IX外顯子連接處TaqMan betaactinGGCACCCAGCACAATGAA1898GGAAGGTGGACAGCGAGG18FAMCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCTAMRA25由于合成后的引物Olig Primer 和Probe呈膜狀附在管壁上，在使用前先瞬時(shí)離心，再輕輕打開(kāi)管蓋。加入滅菌的去離子水，稀釋成100 μmol/ml的貯存液，在使用前調(diào)整終濃度至所需的濃度，置于20℃保存。在稀釋成工作液時(shí)，使Primer的濃度為50 μmol/l，Probe的濃度為10μmol/l。將構(gòu)建成果的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后提取質(zhì)粒，按10倍濃度梯度依次稀釋做為標(biāo)準(zhǔn)品，以此為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)標(biāo)本均在三個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)用三套引物進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)三次。每次均同時(shí)設(shè)置3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)組織標(biāo)本的ERCC1的拷貝數(shù)除以其內(nèi)參betaactin的拷貝數(shù)，其商值作為統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)值。標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建詳見(jiàn)第二章。 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平首先將整個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的分析效率在95%～105%，～。在冰上溶解所需試劑，使用cool start技術(shù)避免非特異性擴(kuò)增。TaqMan探針注意避光，配制過(guò)程中將PCR反應(yīng)管用錫箔紙包裹避光。在冰上配制如下試劑：試劑體積（μl）γTaq酶(5U?μl1)10PCR Buffer（Mg2+Free）5MgCl2(25mmol?l1)3dNTP Mixture( mmol?l1)4模板質(zhì)粒5Primer Forward（50 μmol?l1)1Primer Reverse（50μmol?l1)1TaqMan Probe(10μmol/l)無(wú)菌水加水至50μlTaqMan熒光定量PCR反應(yīng)溫度和時(shí)間控制：95℃預(yù)變性3min；94℃變性1min,60℃退火和延伸1min,熒光探測(cè)；45個(gè)循環(huán)；于10℃保存。TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序設(shè)置Program for TaqMan Realtime quantitative PCR ( Draw by Jiang Sheng)每個(gè)標(biāo)本均在三個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)用三套引物進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)三次。每次均同時(shí)設(shè)置3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。 根據(jù)臨床資料，按照患者對(duì)化療的反應(yīng)性，將患者區(qū)分為化療敏感組和化療耐藥組，使用成組t 檢驗(yàn)比較ERCC1在化療敏感和耐藥組間的表達(dá)差異，取雙側(cè)，以α=。以ERCC1 mRNA表達(dá)量的中位值為界分為ERCC1高表達(dá)組和低表達(dá)組，對(duì)隨訪資料的生存分析采用KaplanMeier法。使用logrank test對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)對(duì)生存期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。將可能影響卵巢癌患者化療反應(yīng)的因素進(jìn)行Logistic多因素統(tǒng)計(jì)回歸，將有關(guān)影響卵巢惡性腫瘤患者生存期的因素進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析。數(shù)據(jù)錄入使用軟件Microsoft Excel 2003, for windows進(jìn)行。3. 結(jié)果所納入的63例卵巢癌患者中位年齡49歲（27歲～67歲）。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（F233。d233。ration Internationale de Gyn233。c