【正文】 和Probe呈膜狀附在管壁上，在使用前先瞬時離心，再輕輕打開管蓋。 TaqMan實時熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá)水平首先將整個反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的分析效率在95%～105%，～。使用logrank test對數(shù)秩檢驗對生存期進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。Obst233。統(tǒng)計分析表明，缺失第VIII外顯子變異剪接體的表達(dá)量與卵巢癌化療反應(yīng)性無關(guān)。177。并推測在高級真核細(xì)胞生物約5％的基因有可變剪接。本次研究的ERCC1第8號外顯子就屬于此種情況，產(chǎn)生缺失ERCC1第8外顯子的機制是外顯子的跳躍。因此，選擇剪接可以造成不同的基因表達(dá)效應(yīng)。（2.）多樣性與復(fù)雜性變異剪接是從相對簡單的基因組提高蛋白質(zhì)組多樣性的重要機制，蛋白質(zhì)組的多樣性與多細(xì)胞高等生物的復(fù)雜性相適應(yīng)。 ERCC1變異剪接在卵巢上皮癌患者中的臨床意義變異剪接（alternative splicing）是真核生物中廣泛存在的一個現(xiàn)象，對腫瘤的生物學(xué)行為有一定的影響，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中也伴隨著一些基因的變異剪接[7]。本次研究所納入的63例患者，%（53例），%，%。%（29例）的患者對化療無反應(yīng)（耐藥），顯示患者對化療的耐藥是一個嚴(yán)重的問題。本次研究結(jié)果亦顯示，若在ERCC1總量中剔除缺失第VIII外顯子變異剪接體的表達(dá)量，僅分析含10個外顯子全長ERCC1的表達(dá)水平與化療反應(yīng)及術(shù)后生存期的關(guān)系，則可以獲得更小的P值，更有統(tǒng)計學(xué)差異。本研究顯示，缺失第VIII外顯子，僅含9個外顯子的ERCC1變異剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不是影響患者預(yù)后的因素，無臨床意義，是無DNA修復(fù)功能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。然而有20%到30% 的患者對一線化療藥物始終無反應(yīng)，初治有反應(yīng)的患者仍有部分會發(fā)生繼發(fā)耐藥，大大降低了化療的效果，患者生存質(zhì)量差，預(yù)后不佳。同時，本次研究結(jié)果也顯示，若在ERCC1總量中剔除缺失第VIII外顯子變異剪接體的表達(dá)量，僅分析含10個外顯子全長ERCC1的表達(dá)水平與化療反應(yīng)及術(shù)后生存期的關(guān)系，則可以獲得更小的P值。本次研究檢測了63例卵巢上皮癌組織中ERCC1基因的mRNA表達(dá)水平，顯示對化療耐藥組的ERCC1 mRNA表達(dá)水平明顯高于敏感組，表明ERCC1與卵巢癌耐藥有關(guān)，其高表達(dá)是卵巢癌的耐藥機制之一。因此，變異剪接是一種在轉(zhuǎn)錄后RNA水平調(diào)控基因表達(dá)的重要機制。端剪接受點的選擇，保留全部外顯子或剪接掉某一外顯子的部分序列；或去掉全部內(nèi)含子或保留某一內(nèi)含子的一部分序列?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的選擇剪接方式主要有以下幾種：1. 外顯子選擇方式可保留或部分保留外顯子：外顯子選擇(optional exon)也稱外顯子跳躍(exon skipping),是指在不同的剪接方式中，某一個外顯子（或幾個外顯子）可以在成熟的mRNA中保留，也可以通過剪接過程被去掉。Survival curve of ovarian cancer patients使用Cox比例風(fēng)險模型（Cox’s proportional hazard model）對影響患者預(yù)后的因素進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示臨床分期，病理學(xué)分級和ERCC1 mRNA（總量）是影響患者預(yù)后的因素，而組織學(xué)類型和ERCC1缺失第VIII外顯子變異剪接體不是影響患者預(yù)后的因素。177。耐藥組的ERCC1表達(dá)水平明顯高于敏感組。ration Internationale de Gyn233。 根據(jù)臨床資料，按照患者對化療的反應(yīng)性，將患者區(qū)分為化療敏感組和化療耐藥組，使用成組t 檢驗比較ERCC1在化療敏感和耐藥組間的表達(dá)差異，取雙側(cè)，以α=。每個組織標(biāo)本的ERCC1的拷貝數(shù)除以其內(nèi)參betaactin的拷貝數(shù)，其商值作為統(tǒng)計分析的數(shù)值。本次研究選擇人betaactin作為內(nèi)參基因，可以滿足以上條件。②高度或中度表達(dá),排除太高或低表達(dá)。一般而言，探針法比染料法（如SYBR Green I）最廣泛使用的TaqMan探針就是運用了這個原理。與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。在擴增反應(yīng)結(jié)束之后，可以通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量的分析 。 TaqMan實時熒光定量PCR實驗原理：定義：實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。l) 1181。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。Oligo（dT）18與隨機六聚體引物適用于兩管RTPCR。結(jié)果見圖。LRNA樣品至150181。(3) 在4℃低溫13000rpm，離心15min。RNA是極易受到RNA酶的降解，在提取RNA過程中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性,%DEPC的水浸泡過夜后高溫高壓消毒。使用時，取20ml加蒸餾水至1000ml，即得1TAE的工作液。(2) RNA酶的去除RNA酶可以降解RNA, 破壞RNA的完整性,影響試驗結(jié)果，所以在提取RNA的整個過程都要嚴(yán)防RNA酶的存在。對化療敏感的定義：完全緩解與部分緩解均為敏感，對化療有反應(yīng)。 T2bⅡc Ⅱa 或Ⅱb病變，但腹水或沖洗液中查見惡性細(xì)胞。cologie et d39。術(shù)前均簽署知情同意書，允許所切除卵巢組織保存于我院并被用于科學(xué)研究。然而有20%到30% 的患者對一線化療藥物始終無反應(yīng)，初治有反應(yīng)的患者仍有部分會發(fā)生繼發(fā)耐藥。ERCC1基因共10個外顯子，可分別轉(zhuǎn)錄為兩個剪接體，含10個外顯子的全長剪接體mRNA (full length, FL),和缺失第VIII外顯子（長72bp）的變異剪接體mRNA( alternative splicing, AS)。：全部標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)師切片確診。Ⅰb 腫瘤局限于兩側(cè)卵巢，包膜完整，表面無腫瘤， T1b腹水或腹腔沖洗液中未查見惡性細(xì)胞。 T3aⅢb 盆腔外腹膜大塊轉(zhuǎn)移灶最大徑線≤2cm T3bⅢc 盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移灶最大徑線2cm， T3c和/或N1和/或區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Ⅳ 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（腹膜轉(zhuǎn)移除外） M1注： 肝包膜轉(zhuǎn)移為T3/Ⅲ期，肝實質(zhì)轉(zhuǎn)移為M1/Ⅳ期。經(jīng)門診隨訪或者電話和信件隨訪。(3) EtBr溶液的配制溴化乙錠EtBr是有毒物質(zhì)，皮膚不可以直接接觸，整個配置過程都要戴橡膠手套，在通風(fēng)廚中進(jìn)行。2 方法：采用Trizol試劑一步法提取卵巢組織RNA：為減少RNA酶的污染，該方法中所用的Tip頭、%二乙基焦碳酸酯(DEPC水)浸泡過夜，高壓消毒除去殘存的DEPC。本試驗采用美國Invitrogen公司的TRIZol試劑提取RNA。(5) 加70%乙醇漂洗沉淀，在4℃低溫5000rpm，離心10min，小心棄去乙醇，空氣中干燥10min。L)=(A260 40稀釋倍數(shù))/1000(2) 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性：選用專用電泳槽、制膠板、梳子，先用無水乙醇擦洗，％DEPC處理過的ddH2O徹底沖洗，再用無水乙醇洗一次，待乙醇揮發(fā)后即可使用。：以提取到的總RNA作為模板，：1. 胸腺嘌呤寡聚體Oligo（dT）182. 隨機六聚體引物random hexamer primer3. 序列特異的引物sequencespecific primer細(xì)胞內(nèi)的mRNA在3’端為polyA，Oligo（dT）18作為引物與polyA互補，使用Oligo（dT）18作為引物能夠?qū)⑺崛〉目俁NA中含有polyA 的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得到的cDNA利于后續(xù)的PCR擴增基因全長，利于構(gòu)建基因全長的載體，而且對于引物與總RNA的比例要求不嚴(yán)體，不需要對引物與總RNA的比例進(jìn)行優(yōu)化。最適作用溫度為37℃。 Eppendorf管內(nèi)加入以下反應(yīng)體系：①總RNA 隨機六聚體引物random hexamer primer 1181。l) 1181。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。在實時熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表 CT 值。 在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR熒光染料， SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5′3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。⑤其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似。加入滅菌的去離子水，稀釋成100 μmol/ml的貯存液，在使用前調(diào)整終濃度至所需的濃度，置于20℃保存。在冰上溶解所需試劑，使用cool start技術(shù)避免非特異性擴增。將可能影響卵巢癌患者化療反應(yīng)的因素進(jìn)行Logistic多因素統(tǒng)計回歸，將有關(guān)影響卵巢惡性腫瘤患者生存期的因素進(jìn)行Cox比例風(fēng)險回歸模型分析。trique, FIGO）2000年修訂的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)來判斷臨床期別，結(jié)果：I期4例（%），II期6例（%