【正文】 和Probe呈膜狀附在管壁上，在使用前先瞬時離心，再輕輕打開管蓋。 TaqMan實時熒光定量PCR檢測mRNA表達水平首先將整個反應條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的分析效率在95%～105%，～。使用logrank test對數秩檢驗對生存期進行統(tǒng)計檢驗。Obst233。統(tǒng)計分析表明，缺失第VIII外顯子變異剪接體的表達量與卵巢癌化療反應性無關。177。并推測在高級真核細胞生物約5％的基因有可變剪接。本次研究的ERCC1第8號外顯子就屬于此種情況，產生缺失ERCC1第8外顯子的機制是外顯子的跳躍。因此，選擇剪接可以造成不同的基因表達效應。（2.）多樣性與復雜性變異剪接是從相對簡單的基因組提高蛋白質組多樣性的重要機制，蛋白質組的多樣性與多細胞高等生物的復雜性相適應。 ERCC1變異剪接在卵巢上皮癌患者中的臨床意義變異剪接（alternative splicing）是真核生物中廣泛存在的一個現(xiàn)象，對腫瘤的生物學行為有一定的影響，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中也伴隨著一些基因的變異剪接[7]。本次研究所納入的63例患者，%（53例），%，%。%（29例）的患者對化療無反應（耐藥），顯示患者對化療的耐藥是一個嚴重的問題。本次研究結果亦顯示，若在ERCC1總量中剔除缺失第VIII外顯子變異剪接體的表達量，僅分析含10個外顯子全長ERCC1的表達水平與化療反應及術后生存期的關系，則可以獲得更小的P值，更有統(tǒng)計學差異。本研究顯示，缺失第VIII外顯子，僅含9個外顯子的ERCC1變異剪接轉錄產物不是影響患者預后的因素，無臨床意義，是無DNA修復功能的轉錄產物。然而有20%到30% 的患者對一線化療藥物始終無反應，初治有反應的患者仍有部分會發(fā)生繼發(fā)耐藥，大大降低了化療的效果，患者生存質量差，預后不佳。同時，本次研究結果也顯示，若在ERCC1總量中剔除缺失第VIII外顯子變異剪接體的表達量，僅分析含10個外顯子全長ERCC1的表達水平與化療反應及術后生存期的關系，則可以獲得更小的P值。本次研究檢測了63例卵巢上皮癌組織中ERCC1基因的mRNA表達水平，顯示對化療耐藥組的ERCC1 mRNA表達水平明顯高于敏感組，表明ERCC1與卵巢癌耐藥有關，其高表達是卵巢癌的耐藥機制之一。因此，變異剪接是一種在轉錄后RNA水平調控基因表達的重要機制。端剪接受點的選擇，保留全部外顯子或剪接掉某一外顯子的部分序列；或去掉全部內含子或保留某一內含子的一部分序列?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的選擇剪接方式主要有以下幾種：1. 外顯子選擇方式可保留或部分保留外顯子：外顯子選擇(optional exon)也稱外顯子跳躍(exon skipping),是指在不同的剪接方式中，某一個外顯子（或幾個外顯子）可以在成熟的mRNA中保留，也可以通過剪接過程被去掉。Survival curve of ovarian cancer patients使用Cox比例風險模型（Cox’s proportional hazard model）對影響患者預后的因素進行多因素分析，結果顯示臨床分期，病理學分級和ERCC1 mRNA（總量）是影響患者預后的因素，而組織學類型和ERCC1缺失第VIII外顯子變異剪接體不是影響患者預后的因素。177。耐藥組的ERCC1表達水平明顯高于敏感組。ration Internationale de Gyn233。 根據臨床資料，按照患者對化療的反應性，將患者區(qū)分為化療敏感組和化療耐藥組，使用成組t 檢驗比較ERCC1在化療敏感和耐藥組間的表達差異，取雙側，以α=。每個組織標本的ERCC1的拷貝數除以其內參betaactin的拷貝數，其商值作為統(tǒng)計分析的數值。本次研究選擇人betaactin作為內參基因，可以滿足以上條件。②高度或中度表達,排除太高或低表達。一般而言，探針法比染料法（如SYBR Green I）最廣泛使用的TaqMan探針就是運用了這個原理。與雙鏈 DNA 結合后，其熒光大大增強。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。在擴增反應結束之后，可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析 。 TaqMan實時熒光定量PCR實驗原理：定義：實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。l) 1181。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。Oligo（dT）18與隨機六聚體引物適用于兩管RTPCR。結果見圖。LRNA樣品至150181。(3) 在4℃低溫13000rpm，離心15min。RNA是極易受到RNA酶的降解，在提取RNA過程中最關鍵的是抑制RNA酶活性,%DEPC的水浸泡過夜后高溫高壓消毒。使用時，取20ml加蒸餾水至1000ml，即得1TAE的工作液。(2) RNA酶的去除RNA酶可以降解RNA, 破壞RNA的完整性,影響試驗結果，所以在提取RNA的整個過程都要嚴防RNA酶的存在。對化療敏感的定義：完全緩解與部分緩解均為敏感，對化療有反應。 T2bⅡc Ⅱa 或Ⅱb病變，但腹水或沖洗液中查見惡性細胞。cologie et d39。術前均簽署知情同意書，允許所切除卵巢組織保存于我院并被用于科學研究。然而有20%到30% 的患者對一線化療藥物始終無反應，初治有反應的患者仍有部分會發(fā)生繼發(fā)耐藥。ERCC1基因共10個外顯子，可分別轉錄為兩個剪接體，含10個外顯子的全長剪接體mRNA (full length, FL),和缺失第VIII外顯子（長72bp）的變異剪接體mRNA( alternative splicing, AS)。：全部標本均經病理科醫(yī)師切片確診。Ⅰb 腫瘤局限于兩側卵巢，包膜完整，表面無腫瘤， T1b腹水或腹腔沖洗液中未查見惡性細胞。 T3aⅢb 盆腔外腹膜大塊轉移灶最大徑線≤2cm T3bⅢc 盆腔外腹膜轉移灶最大徑線2cm， T3c和/或N1和/或區(qū)域淋巴結轉移Ⅳ 遠處轉移（腹膜轉移除外） M1注： 肝包膜轉移為T3/Ⅲ期，肝實質轉移為M1/Ⅳ期。經門診隨訪或者電話和信件隨訪。(3) EtBr溶液的配制溴化乙錠EtBr是有毒物質，皮膚不可以直接接觸，整個配置過程都要戴橡膠手套，在通風廚中進行。2 方法：采用Trizol試劑一步法提取卵巢組織RNA：為減少RNA酶的污染，該方法中所用的Tip頭、%二乙基焦碳酸酯(DEPC水)浸泡過夜，高壓消毒除去殘存的DEPC。本試驗采用美國Invitrogen公司的TRIZol試劑提取RNA。(5) 加70%乙醇漂洗沉淀，在4℃低溫5000rpm，離心10min，小心棄去乙醇，空氣中干燥10min。L)=(A260 40稀釋倍數)/1000(2) 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性：選用專用電泳槽、制膠板、梳子，先用無水乙醇擦洗，％DEPC處理過的ddH2O徹底沖洗，再用無水乙醇洗一次，待乙醇揮發(fā)后即可使用。：以提取到的總RNA作為模板，：1. 胸腺嘌呤寡聚體Oligo（dT）182. 隨機六聚體引物random hexamer primer3. 序列特異的引物sequencespecific primer細胞內的mRNA在3’端為polyA，Oligo（dT）18作為引物與polyA互補，使用Oligo（dT）18作為引物能夠將所提取的總RNA中含有polyA 的mRNA逆轉錄為cDNA，所得到的cDNA利于后續(xù)的PCR擴增基因全長，利于構建基因全長的載體，而且對于引物與總RNA的比例要求不嚴體，不需要對引物與總RNA的比例進行優(yōu)化。最適作用溫度為37℃。 Eppendorf管內加入以下反應體系：①總RNA 隨機六聚體引物random hexamer primer 1181。l) 1181。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行， PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表 CT 值。 在 PCR 反應體系中，加入過量 SYBR熒光染料， SYBR 熒光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR 產物的增加完全同步。在引物的介導下，沿模板向前延伸至探針結合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5′3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。⑤其穩(wěn)定的表達水平與目標基因相似。加入滅菌的去離子水，稀釋成100 μmol/ml的貯存液，在使用前調整終濃度至所需的濃度，置于20℃保存。在冰上溶解所需試劑，使用cool start技術避免非特異性擴增。將可能影響卵巢癌患者化療反應的因素進行Logistic多因素統(tǒng)計回歸，將有關影響卵巢惡性腫瘤患者生存期的因素進行Cox比例風險回歸模型分析。trique, FIGO）2000年修訂的臨床分期標準來判斷臨床期別，結果：I期4例（%），II期6例（%