【正文】 攪拌溶解后放置于棕色瓶中4℃避光保存。使用時(shí)取10mg/ml的貯存液200μl稀釋于10ml三蒸水中。（4）50TAE電泳緩沖液的配制Tris (PH=) 冰醋酸 ，(PH=) ，充分?jǐn)嚢枞芙夂笥萌羲a(bǔ)足至50ml，高壓滅菌后室溫保存，作為貯存液。使用時(shí)，取20ml加蒸餾水至1000ml，即得1TAE的工作液。（5）不同濃度瓊脂糖凝膠配制①％瓊脂糖凝膠 50ml瓊脂糖 1TAE 50ml②％瓊脂糖凝膠 50ml瓊脂糖 1TAE 50ml稱取所需劑量的瓊脂糖粉末，加入所需體積的TAE緩沖液中，置于微波爐中間斷加熱，使瓊脂糖完全溶解，其間不斷緩慢搖動(dòng)錐形瓶，使貼于壁上的瓊脂充分溶解。冷卻至50℃左右，加入200μg/ml溴化乙錠(EB液)125μl混勻()。2 方法：采用Trizol試劑一步法提取卵巢組織RNA：為減少RNA酶的污染，該方法中所用的Tip頭、%二乙基焦碳酸酯(DEPC水)浸泡過(guò)夜，高壓消毒除去殘存的DEPC。進(jìn)口離心管已經(jīng)過(guò)射線消毒，可直接使用；其它玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾干后，再經(jīng)重鉻酸鉀硫酸洗液浸泡過(guò)夜，洗凈后200℃干烤4~6小時(shí)，方能使用。一般去除RNA酶的用具立即使用。人的皮膚是RNA酶污染的重要來(lái)源，用具處理過(guò)程中和試驗(yàn)過(guò)程中均主意戴手套和帽子?？諝庵泻蠷NA酶，去除RNA酶的用具需要用布包裹，容器需要蓋上蓋子，且不宜放置過(guò)久。RNA是極易受到RNA酶的降解，在提取RNA過(guò)程中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性,%DEPC的水浸泡過(guò)夜后高溫高壓消毒。RNA提取基本原理是通過(guò)變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過(guò)氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再經(jīng)過(guò)沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。已經(jīng)有商品化的RNA提取試劑盒出售，如美國(guó)Invitrogen公司的TRIZol和日本Takara公司的RNAiso。本試驗(yàn)采用美國(guó)Invitrogen公司的TRIZol試劑提取RNA。TRIZol為高濃度強(qiáng)變性裂解液，可迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使RNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)，同時(shí)Trizol試劑還含有Rnase抑制劑使細(xì)胞內(nèi)RNA酶失活，RNA不被降解，同時(shí)氯仿能將細(xì)胞碎片、DNA、蛋白質(zhì)與RNA分離開來(lái)，得到純化的總RNA，焦碳酸二乙酯(DEPC)是一種強(qiáng)烈的RNA酶抑制劑，用它來(lái)浸泡實(shí)驗(yàn)所用器具，及配制70%乙醇，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程不產(chǎn)生RNA酶污染，并且使所得RNA有較高的純度，幾乎不含有基因組DNA。實(shí)驗(yàn)步驟：本次研究采用美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑一步法提取卵巢組織總RNA，以便得到高質(zhì)量的RNA，對(duì)卵巢癌組織中的目的mRNA進(jìn)行定量分析。具體步驟如下：(1) 從液氮罐內(nèi)取出保存的卵巢癌組織，并逐一核對(duì)住院號(hào)和姓名，剪取約200mg卵巢癌組織迅速置于液氮中，在液氮中使用研缽將卵巢癌組織研磨成粉末后加入Trizol 試劑1mL，充分混勻。(2) ，充分振蕩混勻，冰浴15min。(3) 在4℃低溫13000rpm，離心15min。(4) ，RNA存在于上層水相，在吸取時(shí)注意不要吸到蛋白層或有機(jī)相，以免蛋白等雜質(zhì)的污染。加等體積異丙醇，搖勻，室溫放置10min，在4℃低溫13000rpm，離心15min，沉淀RNA。(5) 加70%乙醇漂洗沉淀，在4℃低溫5000rpm，離心10min，小心棄去乙醇，空氣中干燥10min。(6) 加入40181。l 經(jīng)DEPC處理過(guò)的，不含RNA酶的雙蒸水完全溶解總RNA。：為了檢測(cè)所提取RNA的純度和質(zhì)量，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA溶液的吸光值，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶。(1) 總RNA定量分析：用ddH2O稀釋3181。LRNA樣品至150181。L，充分混勻；用紫外分光光度儀測(cè)總RNA的OD260、OD280的吸光值，計(jì)算OD260/OD280比值，表明純度符合要求，如低于此值，表明存在蛋白質(zhì)污染，需重新用酚/氯仿抽提。通過(guò)OD260值計(jì)算RNA總濃度：總RNA濃度(ug/181。L)=(A260 40稀釋倍數(shù))/1000(2) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性：選用專用電泳槽、制膠板、梳子，先用無(wú)水乙醇擦洗，％DEPC處理過(guò)的ddH2O徹底沖洗，再用無(wú)水乙醇洗一次，待乙醇揮發(fā)后即可使用。制備1％瓊脂糖凝膠。取2181。L總RNA溶液加1181。L上樣緩沖液點(diǎn)樣，以5V/cm穩(wěn)壓電泳，紫外燈下可見28s、18s、5s三條rRNA的清晰條帶，但是有時(shí)5s條帶并不能總是理想的顯示，本次研究所納入的卵巢癌組織有些在液氮中保存時(shí)間很久，有些不能清晰的顯示5s的rRNA條帶。結(jié)果見圖。Biorad凝膠成像儀成像，使用qualityone軟件分析知其28S條帶亮度是18S亮度的2倍。表明RNA提取的質(zhì)量很好，可以用于本次研究。：以提取到的總RNA作為模板，：1. 胸腺嘌呤寡聚體Oligo（dT）182. 隨機(jī)六聚體引物random hexamer primer3. 序列特異的引物sequencespecific primer細(xì)胞內(nèi)的mRNA在3’端為polyA，Oligo（dT）18作為引物與polyA互補(bǔ)，使用Oligo（dT）18作為引物能夠?qū)⑺崛〉目俁NA中含有polyA 的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得到的cDNA利于后續(xù)的PCR擴(kuò)增基因全長(zhǎng)，利于構(gòu)建基因全長(zhǎng)的載體，而且對(duì)于引物與總RNA的比例要求不嚴(yán)體，不需要對(duì)引物與總RNA的比例進(jìn)行優(yōu)化。隨機(jī)六聚體引物為四種脫氧核糖核酸(A,T,G,C)的隨機(jī)組合，使用此引物逆轉(zhuǎn)錄的cDNA長(zhǎng)短不一，隨機(jī)六聚體引物與總RNA的物質(zhì)的量的比例對(duì)所得到的cDNA長(zhǎng)度有關(guān)鍵性的影響，提高引物與總RNA的比例能夠得到較短的cDNA產(chǎn)物，通常小于500bp。 如果降低引物與總RNA的比例則使長(zhǎng)的cDNA產(chǎn)物增長(zhǎng)。因此實(shí)驗(yàn)前對(duì)隨機(jī)六聚體引物與總RNA的比例進(jìn)行優(yōu)化是必要的。序列特異的引物則適用于單管RTPCR(one tube),逆轉(zhuǎn)錄的引物是針對(duì)目的基因而設(shè)計(jì)的。Oligo（dT）18與隨機(jī)六聚體引物適用于兩管RTPCR。(tow tube).本研究采用兩管RTPCR法，使用隨機(jī)六聚體引物random hexamer primer作為逆轉(zhuǎn)錄引物以便得到較多的cDNA產(chǎn)物。目前廣為使用的逆轉(zhuǎn)錄酶是四種，具體如下：1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱。最適作用溫度為37℃。2． 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+ 存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。4．MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H突變體：商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長(zhǎng)cDNA。本次研究采用Fermentas公司的Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase，(MMuLV RT),此酶具有低的RNase H活性,以便從較長(zhǎng)的模板（最長(zhǎng)可達(dá)13kb）中得到全長(zhǎng)cDNA序列。：所有操作均在冰上進(jìn)行。 Eppendorf管內(nèi)加入以下反應(yīng)體系：①總RNA 隨機(jī)六聚體引物random hexamer primer 1181。l RNase free水 至總體積 12181。l稍離心混勻后，70℃反應(yīng)5分鐘，立即置于冰上冰浴5分鐘②依次加入以下各成分：5Reaction Buffer 4181。l10mMdNTP Mix 2181。lRNA酶抑制劑(RiboLock Ribonuclease inhibitor)(20u/181。l) 1181。l稍離心混勻各成分，由于使用了隨機(jī)六聚體引物random hexamer primer ，故此步驟在25℃下反應(yīng)5分鐘。③加逆轉(zhuǎn)錄酶MMuLV(200u/181。l) 1181。l由于使用了隨機(jī)六聚體引物random hexamer primer ，故此步驟首先在25℃反應(yīng)10分鐘，然后在42℃反應(yīng)60分鐘。72℃10分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶④迅速置于冰浴中5分鐘，以防cDNA結(jié)合成雙鏈⑤20℃保存。⑵質(zhì)量檢測(cè)：，然后加入逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4181。l及上樣緩沖液2ul，電泳使溴酚藍(lán)前移2cm左右，凝膠成像分析儀可見較寬的電泳區(qū)帶呈片狀。 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)原理：定義：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)是 DNA 定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對(duì) DNA 、 RNA 樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量分析包括絕對(duì)定量分析和相對(duì)定量分析。前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對(duì)不同方式處理的兩個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。除此之外還可以對(duì) PCR 產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析：例如利用熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引