【正文】 攪拌溶解后放置于棕色瓶中4℃避光保存。使用時取10mg/ml的貯存液200μl稀釋于10ml三蒸水中。（4）50TAE電泳緩沖液的配制Tris (PH=) 冰醋酸 ，(PH=) ，充分攪拌溶解后用三蒸水補足至50ml，高壓滅菌后室溫保存，作為貯存液。使用時，取20ml加蒸餾水至1000ml，即得1TAE的工作液。（5）不同濃度瓊脂糖凝膠配制①％瓊脂糖凝膠 50ml瓊脂糖 1TAE 50ml②％瓊脂糖凝膠 50ml瓊脂糖 1TAE 50ml稱取所需劑量的瓊脂糖粉末，加入所需體積的TAE緩沖液中，置于微波爐中間斷加熱，使瓊脂糖完全溶解，其間不斷緩慢搖動錐形瓶，使貼于壁上的瓊脂充分溶解。冷卻至50℃左右，加入200μg/ml溴化乙錠(EB液)125μl混勻()。2 方法：采用Trizol試劑一步法提取卵巢組織RNA：為減少RNA酶的污染，該方法中所用的Tip頭、%二乙基焦碳酸酯(DEPC水)浸泡過夜，高壓消毒除去殘存的DEPC。進口離心管已經過射線消毒，可直接使用；其它玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾干后，再經重鉻酸鉀硫酸洗液浸泡過夜，洗凈后200℃干烤4~6小時，方能使用。一般去除RNA酶的用具立即使用。人的皮膚是RNA酶污染的重要來源，用具處理過程中和試驗過程中均主意戴手套和帽子?？諝庵泻蠷NA酶，去除RNA酶的用具需要用布包裹，容器需要蓋上蓋子，且不宜放置過久。RNA是極易受到RNA酶的降解，在提取RNA過程中最關鍵的是抑制RNA酶活性,%DEPC的水浸泡過夜后高溫高壓消毒。RNA提取基本原理是通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。已經有商品化的RNA提取試劑盒出售，如美國Invitrogen公司的TRIZol和日本Takara公司的RNAiso。本試驗采用美國Invitrogen公司的TRIZol試劑提取RNA。TRIZol為高濃度強變性裂解液，可迅速破壞細胞結構，使RNA從細胞中釋放出來，同時Trizol試劑還含有Rnase抑制劑使細胞內RNA酶失活，RNA不被降解，同時氯仿能將細胞碎片、DNA、蛋白質與RNA分離開來，得到純化的總RNA，焦碳酸二乙酯(DEPC)是一種強烈的RNA酶抑制劑，用它來浸泡實驗所用器具，及配制70%乙醇，保證實驗過程不產生RNA酶污染，并且使所得RNA有較高的純度，幾乎不含有基因組DNA。實驗步驟：本次研究采用美國Invitrogen公司生產的Trizol試劑一步法提取卵巢組織總RNA，以便得到高質量的RNA，對卵巢癌組織中的目的mRNA進行定量分析。具體步驟如下：(1) 從液氮罐內取出保存的卵巢癌組織，并逐一核對住院號和姓名，剪取約200mg卵巢癌組織迅速置于液氮中，在液氮中使用研缽將卵巢癌組織研磨成粉末后加入Trizol 試劑1mL，充分混勻。(2) ，充分振蕩混勻，冰浴15min。(3) 在4℃低溫13000rpm，離心15min。(4) ，RNA存在于上層水相，在吸取時注意不要吸到蛋白層或有機相，以免蛋白等雜質的污染。加等體積異丙醇，搖勻，室溫放置10min，在4℃低溫13000rpm，離心15min，沉淀RNA。(5) 加70%乙醇漂洗沉淀，在4℃低溫5000rpm，離心10min，小心棄去乙醇，空氣中干燥10min。(6) 加入40181。l 經DEPC處理過的，不含RNA酶的雙蒸水完全溶解總RNA。：為了檢測所提取RNA的純度和質量，使用紫外分光光度計測量RNA溶液的吸光值，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶。(1) 總RNA定量分析：用ddH2O稀釋3181。LRNA樣品至150181。L，充分混勻；用紫外分光光度儀測總RNA的OD260、OD280的吸光值，計算OD260/OD280比值，表明純度符合要求，如低于此值，表明存在蛋白質污染，需重新用酚/氯仿抽提。通過OD260值計算RNA總濃度：總RNA濃度(ug/181。L)=(A260 40稀釋倍數(shù))/1000(2) 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性：選用專用電泳槽、制膠板、梳子，先用無水乙醇擦洗，％DEPC處理過的ddH2O徹底沖洗，再用無水乙醇洗一次，待乙醇揮發(fā)后即可使用。制備1％瓊脂糖凝膠。取2181。L總RNA溶液加1181。L上樣緩沖液點樣，以5V/cm穩(wěn)壓電泳，紫外燈下可見28s、18s、5s三條rRNA的清晰條帶，但是有時5s條帶并不能總是理想的顯示，本次研究所納入的卵巢癌組織有些在液氮中保存時間很久，有些不能清晰的顯示5s的rRNA條帶。結果見圖。Biorad凝膠成像儀成像，使用qualityone軟件分析知其28S條帶亮度是18S亮度的2倍。表明RNA提取的質量很好，可以用于本次研究。：以提取到的總RNA作為模板，：1. 胸腺嘌呤寡聚體Oligo（dT）182. 隨機六聚體引物random hexamer primer3. 序列特異的引物sequencespecific primer細胞內的mRNA在3’端為polyA，Oligo（dT）18作為引物與polyA互補，使用Oligo（dT）18作為引物能夠將所提取的總RNA中含有polyA 的mRNA逆轉錄為cDNA，所得到的cDNA利于后續(xù)的PCR擴增基因全長，利于構建基因全長的載體，而且對于引物與總RNA的比例要求不嚴體，不需要對引物與總RNA的比例進行優(yōu)化。隨機六聚體引物為四種脫氧核糖核酸(A,T,G,C)的隨機組合，使用此引物逆轉錄的cDNA長短不一，隨機六聚體引物與總RNA的物質的量的比例對所得到的cDNA長度有關鍵性的影響，提高引物與總RNA的比例能夠得到較短的cDNA產物，通常小于500bp。 如果降低引物與總RNA的比例則使長的cDNA產物增長。因此實驗前對隨機六聚體引物與總RNA的比例進行優(yōu)化是必要的。序列特異的引物則適用于單管RTPCR(one tube),逆轉錄的引物是針對目的基因而設計的。Oligo（dT）18與隨機六聚體引物適用于兩管RTPCR。(tow tube).本研究采用兩管RTPCR法，使用隨機六聚體引物random hexamer primer作為逆轉錄引物以便得到較多的cDNA產物。目前廣為使用的逆轉錄酶是四種，具體如下：1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。2． 禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉錄酶：在Mn2+ 存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。4．MMLV反轉錄酶的RNase H突變體：商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。本次研究采用Fermentas公司的Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase，(MMuLV RT),此酶具有低的RNase H活性,以便從較長的模板（最長可達13kb）中得到全長cDNA序列。：所有操作均在冰上進行。 Eppendorf管內加入以下反應體系：①總RNA 隨機六聚體引物random hexamer primer 1181。l RNase free水 至總體積 12181。l稍離心混勻后，70℃反應5分鐘，立即置于冰上冰浴5分鐘②依次加入以下各成分：5Reaction Buffer 4181。l10mMdNTP Mix 2181。lRNA酶抑制劑(RiboLock Ribonuclease inhibitor)(20u/181。l) 1181。l稍離心混勻各成分，由于使用了隨機六聚體引物random hexamer primer ，故此步驟在25℃下反應5分鐘。③加逆轉錄酶MMuLV(200u/181。l) 1181。l由于使用了隨機六聚體引物random hexamer primer ，故此步驟首先在25℃反應10分鐘，然后在42℃反應60分鐘。72℃10分鐘滅活逆轉錄酶④迅速置于冰浴中5分鐘，以防cDNA結合成雙鏈⑤20℃保存。⑵質量檢測：，然后加入逆轉錄產物4181。l及上樣緩沖液2ul，電泳使溴酚藍前移2cm左右，凝膠成像分析儀可見較寬的電泳區(qū)帶呈片狀。 TaqMan實時熒光定量PCR實驗原理：定義：實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量 PCR 技術是 DNA 定量技術的一次飛躍。運用該項技術，可以對 DNA 、 RNA 樣品進行定量和定性分析。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較。除此之外還可以對 PCR 產物或樣品進行定性分析：例如利用熔解曲線分析識別擴增產物和引